Overview
أثناء التصوير الحي ل C. elegans، يمكن استخدام وسادة agarose لعقد النيماتودا دون الإضرار بها أو تجفيفها. يصف هذا الفيديو كيفية إعداد لوحة تركيب بسيطة للفحص المجهري.
Protocol
هذا البروتوكول مقتطف من تيوه وآخرون، النهج الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا العضيات في Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2019).
إعداد الشرائح للتصوير
- إعداد 3-4٪ ث / v مخزون agarose في زجاجة آمنة الميكروويف (3-4 غرام في 100 مل من المياه فائقة الشراء).
ملاحظة: ويمكن استخدام أغار بدلا من الآغروز في نفس التركيز. - تذوب agarose بعناية في فرن الميكروويف، مع الحرص على عدم الغليان، حتى يذوب كل agarose (حل واضح). حافظ على الحل عند 70 درجة مئوية لمنع التجسيد.
ملاحظة: يمكن استخدام مخزون الآغاروز عدة مرات. إعادة تسخين قبل الاستخدام إذا كان الآغاروز قد توطدت. - باستخدام ماصة باستور، ضع قطرة من الآغاروز الذائب على شريحة المجهر.
ملاحظة: تجنب وجود فقاعات الهواء في قطرة من أجار وهذه تعطل سلامة لوحة. - اضغط على الفور أسفل قطرة agarose مع شريحة المجهر آخر، تسطيح بلطف agarose في لوحة بين الشرائح اثنين.
ملاحظة: يجب إزالة أي فقاعات متبقية في هذه المرحلة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، يجب تقديم شرائح جديدة حيث يمكن للحيوانات أن تتعثر بسهولة في الفقاعات. تجنب تجاوز أجار إلى الجانب عند الضغط على الشريحة. - اتركي الآجروز ليجفف لمدة دقيقة واحدة.
- فصل بعناية الشرائح اثنين لتجنب الضرر الذي لحق agarose، في حين ترك لوحة صلبة على واحدة من الشرائح.
ملاحظة: الشرائح مع منصات agarose ينبغي دائما أن تكون مستعدة طازجة قبل التجربة لأنها يمكن أن تجف. تأكد من أن لوحة الآغاروز لها سمك ثابت. يجب أن لا يكون هناك فقاعات الهواء أو الشقوق في لوحة لأن هذا قد تتداخل مع التصوير. - إضافة قطرة صغيرة (5-10 ميكرولتر) من 0.05٪ رابع ميثيل هيدروكلوريد (مخدر) إلى مركز لوحة الآغاروز.
- باستخدام اختيار الحرارة المعقمة، ونقل بسرعة حوالي 10 - 15 الحيوانات من لوحة المخزون إلى قطرة مخدر قبل أن يجف الحل. تجنب نقل الكثير من البكتيريا OP50 لأن هذا يجعل الحل غائما ، والذي يمكن أن تتداخل مع التصوير.
ملاحظة: إذا كان الحل مخدر يجف أثناء التقاط، ببساطة ماصة قطرة ثانية من 0.05٪ رابع أميسول هيدروكلوريد على الحيوانات. تميل الحيوانات إلى الاستلقاء على جانبها الجانبي في محلول التخدير. - تطبيق coverlip عن طريق وضعه فقط فوق لوحة agarose وإسقاط بلطف عليه. وهذا من شأنه أن يمنع تشكيل فقاعات. لا تضغط على غطاء الغطاء لأن هذا قد يسحق الحيوانات.
- تسمية الشرائح مع اسم سلالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
