Overview
在 C.elegans的实时成像过程中,一个糖垫可以用来保持线虫静止,而不会损坏或干燥线虫。 此视频描述了如何为显微镜准备一个简单的安装垫。
Protocol
本协议摘自Teoh等人的《研究细胞结构和细胞形态学的定量方法》,J.Vis.Exp.(2019年)。
为成像准备幻灯片
- 在微波安全瓶中准备 3-4% 的带 v agarose 库存(100 mL 超纯水中 3-4 克)。
注: 阿加可以代替同浓度的蔗糖。 - 小心地将蔗糖融化在微波炉中,注意不要煮沸,直到所有糖溶解(清除溶液)。将溶液保持在70°C,以防止凝固。
注: 阿加罗斯股票可以使用几次。如果阿加罗斯已经凝固,请在使用前重新加热。 - 使用巴斯德移液器,将一滴融化的糖放在显微镜滑梯上。
注: 避免在 agar 滴中出现气泡,因为这些气泡会破坏垫子的完整性。 - 立即用另一个显微镜滑梯压下糖滴,轻轻地将糖压平到两个幻灯片之间的垫子中。
注: 在这个阶段,任何剩余的气泡都应该去除。否则,应该制作新的幻灯片,因为动物很容易陷入气泡中。按滑梯时,避免阿加溢出到侧面。 - 让阿加罗斯晾干1分钟。
- 小心地将两个幻灯片分开,以避免对 agarose 造成损坏,同时将凝固的垫子留在幻灯片上。
注: 带糖垫的滑梯应始终在实验前准备新鲜,因为它们可以干涸。确保糖垫具有一致的厚度。垫子上不应有气泡或裂缝,因为这可能会干扰成像。 - 将 0.05% 盐酸四甲酸四甲二烯(麻醉剂)的小滴(5-10 μL)添加到糖垫的中心。
- 使用热消毒精选,在溶液干涸之前,快速将大约 10 - 15 只动物从股票板转移到麻醉液滴。避免转移过多的 OP50 细菌,因为这样可以使溶液多云,从而干扰成像。
注: 如果麻醉液在采摘时干燥,只需将第二滴 0.05% 四甲基盐酸滴到动物身上即可。动物往往躺在麻醉液的侧面。 - 应用盖片,将其定位在糖垫正上方,然后轻轻地将其放下。这将防止气泡的形成。不要对盖子滑动施加压力,因为这可能会压碎动物。
- 用应变名称标记幻灯片。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |