Overview
Dieses Video beschreibt eine Technik, um schnell eine einzelne Nematode auf einen genetischen Marker durch PCR-Screening zu überprüfen. Im Beispielprotokoll wird auf CRISPR-basierte Genombearbeitung überprüft.
Protocol
Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
Single Worm PCR und Genotypisierung
- Nach 1 - 2 Tagen Eiablage die F1s mit einem Wurm-Pick in einzelne PCR-Streifenrohrkappen mit 7 l Wurmlysepuffer geben(Tabelle 1, Abbildung 1D, Tag 4 - 5).
- Zentrifugen-PCR-Rohre mit maximaler Geschwindigkeit von 1 min bei Raumtemperatur, um Tiere auf den Rohrboden zu bringen, und Gefrierrohre bei -80 °C für 1 h.
HINWEIS: Würmer können bei -80 °C unbegrenzt gelagert werden. - Gefrorene Schnecken in einem Thermocycler mit folgendem Programm lysieren: 60 °C für 60 min, 95 °C für 15 min, 4 °C halten.
- Einrichtung pcR mastermix wie in Tabelle 2dargestellt .
- Fügen Sie 21 L PCR-Mastermix in saubere PCR-Röhren ein, und fügen Sie dann 4 L Wurmlyse aus Schritt 3 hinzu. Mischen Sie gut mit einer Pipette und führen Sie PCR-Programm nach den Herstellerrichtlinien (siehe Materialtabelle).
- Reinigen Sie PCR-Reaktionen mit einem DNA Clean and Concentrate Kit nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Elute DNA durch Zugabe von 10 L Wasser zur Spinspalte.
- Setup-Restriktionsenzym-Mastermix wie in Tabelle 3dargestellt .
- Fügen Sie jeder gereinigten PCR-Reaktion 10 l des Restriktionsenzym-Mastermix hinzu und brüten sie für 1 - 2 h bei 37 °C.
- Separate verdautPCR-Produkte auf einem 1,5% Agarose-Gel laufen bei 120 V mit 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer.
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Representative Results
Abbildung 1. CRISPR-Cas9-Konstruktion desC. eleganssod-1-Lokus. (A) Schematische Abbildung der Exon-Intron-Struktur des Sod-1-Lokus in C. elegans. Der rote Balken bezeichnet die Lage von G93 in exon 3. Das Grundierungspaar wird durch die roten Pfeile (F1-R1) notiert. (B) Sequenzausrichtung von humanen und C. elegans (Wurm) SOD-1-Proteinen. Der angestrebte G93-Rückstand ist rot hervorgehoben. (C) Topwird ein Abschnitt der genomischen DNA, der das G93-Codon umgibt, als Referenz dargestellt, und die PAM-Standorte (grün) und sgRNA (blau) werden hervorgehoben. Untenwird die einsträngige Oligonukleotid-Homologie (ssODN) Homologie-Vorlage (HDR) gezeigt, die Folgendes enthält: die Codon-Bearbeitung, die G93 in A93 ändert, eine stille Änderung des PAM-Motivs, um Spaltung durch den sgRNA-Cas9-Komplex zu verhindern, eine stille Änderung, um eine einzigartige HindIII-Restriktionsenzym-Site (gelbe Box) einzuführen, und flankierende 5' und 3' 50 bp homology Arme (black bars). Alle in der ssODN entworfenen Nukleotidänderungen sind rot hervorgehoben. (D) Schematische Darstellung der Pipeline zum Generieren und Identifizieren von CRISPR-Cas9 RNP-basierten Punktmutanten. Am Tag 0 10 - 15 P0 Tiere mit Injektionsmischung injizieren. Identifizieren Sie am Tag 2 - 3 erfolgreich injizierte P0-Tiere von Tieren, die fluoreszierende F1-Nachkommen enthalten, und wählen Sie drei P0-Platten mit der fluoreszierendsten Nachkommenschaft aus. Von jeder der drei P0-Platten, einzelne 8 fluoreszierende F1 Nachkommen. Am Tag 4 - 5, a) Schritt 1 werden einzelne F1s entnommen und in PCR-Rohre mit Lysispuffer gelegt; b) Schritt 2 werden nach dem Einfrieren bei -80 °C PCR-Röhren, dieF1-Würmer enthalten, lysiert, um genomische DNA freizusetzen, die als PCR-Vorlage verwendet wird. Die PCR-Produkte werden dann mit dem einzigartigen Restriktionsenzym gereinigt und verdaut; c) Enzymverdautprodukte werden auf einem Agaro-Gel gelöst, bei dem Wildarten (+/+), heterozygote (m/+) und homozygote (m/m) Tiere durch Restriktions-Digest-Banding-Muster identifiziert werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | [Endgültig] |
| Kcl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8,3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| Proteinase K | 1 mg/ml |
Tabelle 1. Wurm Lysis Puffer Rezept. Proteinase K sollte vor jeder Anwendung frisch zugegeben werden.
| Reagenz | 1x | 24-fach |
| 2X Q5 Mastermix | 12,5 l | 300 l |
| Primer F1 (10 m) | 1,25 l | 30 l |
| Primer R1 (10 m) | 1,25 l | 30 l |
| Wurm Lysis | 4 l | ---- |
| ddH2O | 6 l | 144 l |
| Endband | 25 l | 504 l |
Tabelle 2. PCR Mastermix. Der PCR-Mastermix sollte gut durch Pipettieren gemischt werden, bis die Lösung homogen ist. 21 L des PCR-Mastermix sollten zu sauberen PCR-Röhren hinzugefügt werden, und dann sollten 4 l des einzelnen Wurmlysats den ordnungsgemäß beschrifteten Röhren zugesetzt werden.
| Reagenz | 1x | 24-fach |
| 10X Enzympuffer | 2 l | 48 l |
| Gesäuberte PCR-Reaktion | 10 l | ---- |
| ddH2O | 7 l | 168 l |
| Restriktionsenzym (10 U/L) | 1 L | 24 l |
| Endband | 20 l | 240 l |
Tabelle 3. Einschränkung Enzym Mastermix. Der Restriktionsenzym-Mastermix sollte gut durch Pipettieren gemischt werden, bis die Lösung homogen ist. 10 l des Restriktionsenzym-Mastermix sollten 10 l des gereinigten PCR-Produkts zugesetzt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
