Overview
このビデオでは、PCRスクリーニングによって単一の線虫を遺伝子マーカーに対して迅速にスクリーニングする手法について説明します。プロトコルの例では、CRISPRベースのゲノム編集をスクリーニングします。
Protocol
以下のプロトコルは、CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質を使用してC.エレガンスでゲノムポイント変異体を生成するための迅速かつファシリティパイプライン、J.Vis.Expからの抜粋である。(2018).
単一ワーム PCR とジェノタイピング
- 産卵の1-2日後、ワームピックを使用してワームリシスバッファーの7 μLを含む個々のPCRストリップチューブキャップにF1sを移す(表1、図1D、4日目-5)。
- 遠心分離機 PCR チューブは、最高速度で 1 分間、室温で 1 分間、動物をチューブ底部に持ち込み、-80 °C で 1 時間凍結します。
注: ワームは、-80°Cで無期限に保存することができます。 - 以下のプログラムを使用してサーモサイクラーで凍結したワームを凍結:60°C60分、15分間95°C、4°Cホールド。
- 表 2に示すように PCR マスターミックスをセットアップします。
- 21 μL の PCR マスターミックスをクリーン PCR チューブに加え、ステップ 3 から 4 μL のワームリシスを追加します。ピペットを使用してよく混合し、メーカーのガイドラインに従ってPCRプログラムを実行します(材料表を参照)。
- メーカーの指示に従って、DNAクリーンと濃縮キットを使用してPCR反応を精製します(材料表を参照)。スピンカラムに10μLの水を加えてDNAを溶出させます。
- 表 3に示すように制限酵素マスターミックスを設定します。
- 各洗浄PCR反応に制限酵素マスターミックスの10 μLを加え、37°Cで1〜2時間インキュベートします。
- 1xトリス酢酸EDTA(TAE)バッファーを使用して120 Vで1.5%アガロースゲルで実行される1.5%のアガロースゲルで別々の消化PCR産物。
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Representative Results
図 1.C.エレガンソド-1遺伝子座のCRISPR-Cas9エンジニアリング。(A) C.エレガンスにおけるソド-1軌跡のエキソンイントロン構造を描いた模式図。赤いバーは、エキソン3のG93の位置を示します。プライマー対セットは赤い矢印(F1-R1)で示される。(B) ヒトおよびC.エレガンス(ワーム)SOD-1タンパク質の配列アライメント。標的G93残基は赤色で強調表示されます。(C)上、G93コドンを取り囲むゲノムDNAの一部を基準として示し、PAM(緑色)およびsgRNA標的(青)部位が強調表示される。下に、一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)相同性指向修復(HDR)テンプレートが含まれている:コドン編集はG93をA93に変え、sgRNA-Cas9複合体による切断を防ぐためにPAMモチーフに静かな変更を行い、独特のHindIII制限酵素部位(黄色の箱)を導入するサイレントチェンジ、および横向き5'と3'50bpアームズ(ブラックバー)を含む。ssODNで設計されたすべてのヌクレオチド変化は赤色で強調表示される。(D) CRISPR-Cas9 RNPベースのポイント変異体を生成および同定するためのパイプラインの概略図。0日目に、10~15P0の動物を注射ミックスで注入する。2日目~3日目に、蛍光F1プロゲニーを含む動物によってP0動物を正常に注入し、蛍光性の高いP0プレートを3枚選択します。3つのP0プレートのそれぞれから、単一8蛍光F1子孫。4日目~5日目、(a)ステップ1では、個々のF1sが選ばれ、リシスバッファーを含むPCRチューブに配置されます。(b)工程2は、−80°Cで凍結した後、F1ワームを含むPCRチューブを、PCR鋳型として使用されるゲノムDNAを放出するために、リセ化される。PCR産物は、その後、独自の制限酵素で洗浄され、消化されます。(c)ステップ3は、酵素消化産物がアガロースゲル上で分解され、野生型(+/+)、ヘテロ接合(m/+)、ホモ接合(m/m)動物を制限消化バンドパターンによって同定することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
試薬 | [最終版] |
KCl | 50mM |
トリス-HCl pH 8.3 | 10mM |
MgCl2 | 2.5 mM |
NP-40 | 0.45% |
トゥイーン-20 | 0.45% |
プロテイナーゼ K | 1 mg/mL |
表 1.ワームのリシスバッファのレシピ。プロテイナーゼKは、各使用前に新鮮に添加する必要があります.
試薬 | 1x | 24倍 |
2X Q5 マスターミックス | 12.5 μL | 300 μL |
プライマー F1 (10 μM) | 1.25 μL | 30 μL |
プライマー R1 (10 μM) | 1.25 μL | 30 μL |
ワームリシス | 4 μL | ---- |
ddH2O | 6 μL | 144 μL |
最終ボリューム | 25 μL | 504 μL |
表 2.PCR マスターミックス。 PCR マスターミックスは、溶液が均一になるまでピペッティングすることによってよく混合する必要があります。PCRマスターミックスの21 μLをクリーンなPCRチューブに追加し、適切に標識されたチューブに4μLの個々のワームリセートを加える必要があります。
試薬 | 1x | 24倍 |
10X酵素バッファー | 2 μL | 48 μL |
洗浄PCR反応 | 10 μL | ---- |
ddH2O | 7 μL | 168 μL |
制限酵素(10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
最終ボリューム | 20 μL | 240 μL |
表 3.制限酵素マスターミックス。 制限酵素マスターミックスは、溶液が均一になるまでピペッティングすることによってよく混合する必要があります。制限酵素マスターミックスの10 μLを、洗浄PCR産物の10 μLに添加する必要があります。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
KCl | Sigma | P5405 | |
DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
MgCl2 | Sigma | M2393 | |
NP-40 | Sigma | 74385 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |