Overview
이 비디오는 PCR 스크리닝에 의한 유전 마커를 위한 단일 선충을 빠르게 스크린하는 기술을 기술합니다. 예제 프로토콜에서 CRISPR 기반 게놈 편집을 검사합니다.
Protocol
다음 프로토콜은 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질, J. Vis. Exp를 사용하여 C. elegans에서 게놈 점 돌연변이를 생성하기 위한 빠른 및 촉진 파이프라인에서 발췌한 것입니다. (2018).
단일 웜 PCR 및 Genotyping
- 1 -2 일 계란 누워 후, 벌레 선택을 사용하여 벌레 리시스 버퍼의 7 μL을 포함하는 개별 PCR 스트립 튜브 캡에 F1s를 전송(표 1, 도 1D,일 4 - 5).
- 원심분리기 PCR 튜브는 실온에서 1분 동안 최대 속도로 튜브 바닥에 동물을 가져오고, 튜브를 -80°C에서 1시간 동안 동결한다.
참고: 웜은 -80°C에서 무기한 으로 저장할 수 있습니다. - 다음 프로그램을 사용하여 열순환기에서 용액 동결 웜: 60°C 60분, 15분 동안 95°C, 4°C 홀드.
- 표 2에표시된 대로 설정PCR 마스터믹스.
- PCR 마스터믹스 21μL을 깨끗한 PCR 튜브에 추가한 다음 3단계에서 4μL의 웜 리시스를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 잘 섞고 제조업체 지침에 따라 PCR 프로그램을 실행합니다(재료 표참조).
- DNA 클린 및 농축 키트를 사용하여 PCR 반응을 정화하고 제조업체 지침에 따라 (재료 표참조). 스핀 컬럼에 10 μL 물을 추가하여 DNA를 엘ute합니다.
- 표 3에도시된 설정 제한 효소 마스터믹스.
- 각 청소 된 PCR 반응에 제한 효소 마스터 믹스의 10 μL을 추가하고 37 ° C에서 1 - 2 시간 동안 배양하십시오.
- 1x Tris-acetate-EDTA(TAE) 버퍼를 사용하여 120V에서 1.5% 아가로즈 젤로 분리된 소화PCR 제품.
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Representative Results
그림 1. C.eleganssod-1 궤적의 CRISPR-Cas9 엔지니어링. (A) C. 예인단에서 소드-1 궤적의 엑손인트론 구조를 묘사한 회로도 일러스트. 빨간색 막대는 엑슨 3에서 G93의 위치를 나타냅니다. 프라이머 쌍 세트는 빨간색 화살표(F1-R1)로 표시됩니다. (B)인간 과 C. elegans (웜) SOD-1 단백질의 서열 정렬. 대상 G93 잔류물이 빨간색으로 강조 표시됩니다. (C) 상단,G93 코동을 둘러싼 게놈 DNA의 단면이 참고로 표시되고, PAM(green) 및 sgRNA 표적(blue) 부위가 강조된다. 하단,단일 좌초 올리고뉴클레오티드(ssODN) 상동성 지향 수리(HDR) 템플릿이 포함되어 있는 것으로 나타났다: 코돈 편집 G93을 A93으로 변경하고, SgRNA-Cas9 컴플렉스에 의한 분열을 방지하기 위한 PAM 모티브에 대한 침묵의 변화, 독특한 힌드III 제한 효소 사이트(노란색 상자) 및 측면 5'(5' 암)를 도입하는 침묵의 변화. ssODN에서 설계된 모든 뉴클레오티드 변화는 빨간색으로 강조된다. (D)CRISPR-Cas9 RNP 기반 점 돌연변이를 생성하고 식별하기 위한 파이프라인의 회로도 그림. 0일째에는 주사 믹스로 10-15 P0 동물을 주입하십시오. 2일차 -3일에는 형광 F1 자손을 함유한P0 동물을 성공적으로 식별하고, 가장 형광선이 가장 많은 P0 플레이트 3개를 선택한다. 각각 3개의 P0 플레이트에서, 단일 8형광 F1 자손. 4일째 - 5, (a) 1단계, 개별 F1s를 골라 서해 가루가 포함된 PCR 튜브에 배치됩니다. (b) 2단계, -80°C에서 동결후,F1 웜을 함유한 PCR 튜브는 PCR 템플릿으로 사용되는 게놈 DNA를 방출하기 위해 용액된다. PCR 제품은 다음 세척 하 고 독특한 제한 효소와 소화; (c) 3단계, 효소 소화 제품은 아가로즈 젤에서 해결되며 야생형(+/+), 이테로지구우스(m/+), 동종구(m/m) 동물은 변조 된 밴딩 패턴에 의해 식별될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | [최종] |
| KCl | 50mM |
| 트리스-HCl pH 8.3 | 10mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| 트웬-20 | 0.45% |
| 프로틴아제 K | 1 mg/mL |
표 1. 웜 리시스 버퍼 레시피. Proteinase K는 각 사용 전에 신선하게 첨가해야 합니다.
| 시약 | 1x | 24x |
| 2X Q5 마스터믹스 | 12.5 μL | 300 μL |
| 프라이머 F1 (10 μM) | 1.25 μL | 30 μL |
| 프라이머 R1 (10 μM) | 1.25 μL | 30 μL |
| 웜 리시스 | 4 μL | ---- |
| ddH2O | 6 μL | 144 μL |
| 최종 볼륨 | 25 μL | 504 μL |
표 2. PCR 마스터 믹스. PCR 마스터믹스는 용액이 균일할 때까지 파이펫팅으로 잘 혼합되어야 합니다. PCR 마스터믹스의 21 μL을 깨끗한 PCR 튜브에 추가한 다음 개별 웜 리세이트 4μL을 적절히 표지된 튜브에 추가해야 합니다.
| 시약 | 1x | 24x |
| 10X 효소 버퍼 | 2 μL | 48 μL |
| 청소된 PCR 반응 | 10 μL | ---- |
| ddH2O | 7 μL | 168 μL |
| 제한 효소 (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| 최종 볼륨 | 20 μL | 240 μL |
표 3. 제한 효소 마스터 믹스. 제한 효소 마스터믹스는 용액이 균일할 때까지 파이펫팅에 의해 잘 혼합되어야 합니다. 제한 효소 마스터믹스의 10 μL을 세척 PCR 제품의 10 μL에 첨가해야 합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
