PCR de worm único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

Overview

Este vídeo descreve uma técnica para testar rapidamente um único nematoide para um marcador genético por triagem PCR. No protocolo de exemplo, nós examinamos para edição de genoma baseada em CRISPR.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR e Genotipagem de Worm Único

1. Após 1 - 2 dias de colocação de ovos, transfira o F₁s para tampas individuais de tubo de tira PCR contendo 7 μL de Worm Lysis Buffer usando uma picareta de worm(Tabela 1, Figura 1D, dia 4 - 5).
2. Centrífuga tubos PCR em velocidade máxima de 1 minuto à temperatura ambiente para trazer animais para o fundo do tubo, e congelar tubos a -80 °C por 1 h.
   NOTA: Os vermes podem ser armazenados a -80 °C indefinidamente.
3. Vermes congelados lyse em um termociclador usando o seguinte programa: 60 °C para 60 min, 95 °C para 15 min, 4 °C de espera.
4. Configuração do mastermix pcr como mostrado na Tabela 2.
5. Adicione 21 μL de PCR mastermix em tubos PCR limpos e, em seguida, adicione 4 μL de lise de vermes a partir da etapa 3. Misture bem usando uma pipeta e execute o programa PCR seguindo as diretrizes dos fabricantes (ver Tabela de Materiais).
6. Purifique as reações do PCR usando um kit DE DNA Limpo e Concentrado, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). DNA elute adicionando 10 μL de água à coluna de giro.
7. Configuração de enzimas de restrição de configuração mastermix como mostrado na Tabela 3.
8. Adicione 10 μL da enzima de restrição mastermix a cada reação pcr limpa e incubar por 1 - 2 h a 37 °C.
9. Produtos PCR digeridos separados em um gel de 1,5% agarose executado a 120 V usando 1x Tris-acetato-EDTA (TAE).

Representative Results

Figura 1. Engenharia CRISPR-Cas9 dolócus C. eleganssod-1. (A) Ilustração esquemática representando a estrutura exon-intron do lócus sod-1 em C. elegans. A barra vermelha denota a localização do G93 no exon 3. O conjunto de pares de primer é notado pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) Alinhamento sequencial das proteínas humanas e C. elegans (verme) SOD-1. O resíduo G93 direcionado é destacado em vermelho. (C) Topo, uma seção de DNA genômico em torno do códon G93 é mostrada como referência, e os locais pam (verde) e sgRNA target (azul) são destacados. Na parte inferior, o modelo de oligonucleotídeo único de oligonucleotídeo (ssODN) é mostrado contendo: a edição do codon edit mudando G93 para A93, uma mudança silenciosa para o motivo PAM para evitar o decote pelo complexo sgRNA-Cas9, uma mudança silenciosa para introduzir um local de enzima de restrição hindiii único (caixa amarela) e flanqueamento de 5' e 3' 50 bp homologia (barras pretas). Todas as alterações de nucleotídeos projetadas no ssODN são destacadas em vermelho. (D) Ilustração esquemática do gasoduto para geração e identificação de mutantes de ponto baseados em CRISPR-Cas9 RNP. No dia 0, injete 10 - 15 P₀ animais com mistura de injeção. No dia 2 - 3, identifique com sucesso animais P₀ injetados por aqueles que contêm progênero F₁ fluorescente, e selecione três placas P₀ com a prole mais fluorescente. De cada uma das três placas P_0, prole f₁ fluorescente única 8. No dia 4 - 5, (a) passo 1, f₁s individuais são colhidos e colocados em tubos PCR contendo Tampão de Lysis; b Etapa 2, após o congelamento a -80 °C, os tubos PCR contendo vermes F₁ são líscidos para liberar DNA genômico, que é usado como modelo PCR. Os produtos PCR são então limpos e digeridos com a enzima de restrição única; c O passo 3, os produtos digeridos enzimados são resolvidos em um gel de agarose onde animais do tipo selvagem (+++), heterozigos (m/+) e homozigos (m/m) podem ser identificados por padrões de banda de digestão de restrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Reagente	[Final]
HCO	50 mM
Tris-HCl pH 8.3	10 mM
MgCl2	2,5 mM
NP-40	0.45%
Tween-20	0.45%
Proteinase K	1 mg/mL

Mesa 1. Receita tampão de lysis worm. Proteinase K deve ser adicionado fresco antes de cada uso.

Reagente	1x	24x
2X Q5 Mastermix	12,5 μL	300 μL
Primer F1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Primer R1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Lysis-de-verme	4 μL	----
ddH2O	6 μL	144 μL
Final Volume	25 μL	504 μL

Mesa 2. PCR Mastermix. O mastermix pcr deve ser bem misturado por pipetação até que a solução seja homogênea. 21 μL do maçodo PCR deve ser adicionado aos tubos PCR limpos e, em seguida, 4 μL de lysato de vermes individuais devem ser adicionados a tubos devidamente rotulados.

Reagente	1x	24x
Tampão de enzima 10X	2 μL	48 μL
Reação de PCR Limpo	10 μL	----
ddH2O	7 μL	168 μL
Enzima de restrição (10 U/μL)	1 μL	24 μL
Final Volume	20 μL	240 μL

Mesa 3. Enzima de restrição Mastermix. A enzima de restrição mastermix deve ser bem misturada por pipetação até que a solução seja homogênea. 10 μL da enzima de restrição mastermix deve ser adicionado a 10 μL de produto PCR limpo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780