सी एलिगेंसका नील लाल धुंधला: फिक्स्ड जानवरों में लिपिड बूंदों की कल्पना करने के लिए एक विधि

Overview

इस वीडियो में नील लाल डाई का उपयोग कर पूरे, निश्चित कीड़े में लिपिड दाग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।  लिपिड बूंदों के मूल में तटस्थ लिपिड को विशेष रूप से देखने के लिए, दाग सी एलिगेंस के हरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की छवि।

Protocol

यह प्रोटोकॉल एस्कोसिया एट अल,लिपिड बहुतायत का क्वांटिफिकेशन और नील लाल और तेल लाल ओ स्टेनिंग, जे विस एक्सप्रेस (2018) द्वारा कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में लिपिड वितरण का मूल्यांकन है।

1. नील लाल (एनआर) लिपिड के धुंधला

1. 5 मिलीग्राम/एमएल एनआर स्टॉक समाधान की तैयारी
   1. 500 एमएल की बोतल में 100 मिलीग्राम एनआर पाउडर डालकर 100% एसीटोन की 200 मिलीग्राम की एल.
   2. प्रकाश के लिए किसी भी जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बोतल को कवर करें।
   3. उपयोग से पहले, अंधेरे में 2 घंटे के लिए समाधान हिलाएं।
   4. लंबे समय तक उपयोग के लिए, एनआर स्टॉक समाधान को बिना किसी हल्के एक्सपोजर के कसकर सील की गई बोतल में स्टोर करें। शोध की जरूरतों के अनुसार स्केल एनआर स्टॉक समाधान। सुनिश्चित करें कि एक ही स्टॉक समाधान लगातार धुंधला और इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए एनआर-धुंधला प्रयोगों में प्रयोग किया जाता है।
2. एनआर वर्किंग सॉल्यूशन की तैयारी
   1. 40% आइसोप्रोपनॉल (v/v) के प्रत्येक 1 एमएल के लिए, एनआर स्टॉक समाधान के 6 माइक्रोन जोड़ें।
   2. प्रत्येक नमूने के लिए एनआर वर्किंग सॉल्यूशन के 600 माइक्रोन तैयार करें।
      नोट: धुंधला होने से ठीक पहले फ्रेश एनआर वर्किंग सॉल्यूशन बनाएं। एनआर स्टॉक समाधान की जरूरतों के आधार पर, या तो 15 एमएल या 50 एमएल स्नातक शंकु नली का उपयोग करें।
3. एनआर लिपिड धुंधला के लिए कीड़े की तैयारी
   1. देर से लॉग OP50 ई. कोलाईके साथ वरीयता प्राप्त नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) पर 20 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक L4 चरण के लिए कीड़े बढ़ें ।
   2. 1x फॉस्फेट-बफर खारा + 0.01% ट्राइटन एक्स-100 (पीबीएसटी) समाधान के 1 मिलील के साथ प्लेट से कीड़े धोएं और 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में वर्म सस्पेंशन डालें।
   3. 1 मिनट के लिए 560 x ग्राम पर कीड़े को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट निकालें और इस कदम को तब तक दोहराएं जब तक ई कोलाई को निलंबन से मंजूरी नहीं मिल जाती।
   4. कृमि गोली में 40% आइसोप्रोपैनॉल का 100 माइक्रोन जोड़ें और इसे 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
   5. 1 मिनट के लिए 560 x ग्राम पर कीड़े को अपकेंद्रित्र करें और कीड़ा गोली को बाधित किए बिना सुपरनेट को हटा दें।
      नोट: यदि बड़ी प्लेटों का उपयोग कर या प्लेट प्रति अधिक कीड़े धुंधला प्लेटों से कीड़े धोने के लिए PBST की उच्च मात्रा का उपयोग करें । नमूना निर्धारण से पहले पीबीएसटी में कीड़े को 15 मिनट से अधिक न धोएं। यदि सुपरनैंट बैक्टीरिया से साफ नहीं होता है तो अतिरिक्त धोएं करें। एक नटेटर या रॉकर का उपयोग करके 40% आइसोप्रोपेनॉल में इनक्यूबेशन करें। हमेशा ट्यूबों की निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें कि पूर्ण नमूना आंदोलन हो रहा है ।
4. एनआर के साथ लिपिड धुंधला
   1. अंधेरे में, प्रत्येक नमूने में एनआर वर्किंग सॉल्यूशन के 600 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूबों को तीन बार उलटा करें और एनआर समाधान में कीड़े को पूरी तरह से मिलाएं।
   2. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूना घुमाएं।
   3. इनक्यूबेशन के बाद, 1 मिनट के लिए 560 x ग्राम पर कीड़े को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनैंट को हटा दें।
   4. पीबीएएसटी के 600 माइक्रोन जोड़ें और अतिरिक्त एनआर दाग को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए अंधेरे में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
   5. 1 मिनट के लिए 560 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट के सभी लेकिन लगभग 50 माइक्रोन निकालें।
      नोट: एनआर इनक्यूबेशन को आंदोलन की जरूरत नहीं है। इस चरण के दौरान कीड़े का निपटारा आम है।
5. माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए स्लाइड की तैयारी
   1. शेष सुपरनैंट में कीड़ा गोली को फिर से खर्च करें।
   2. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कृमि निलंबन के 5 μL रखें और किसी भी हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए ध्यान से पर एक कवरलिप डाल दिया।
   3. इमेजिंग कीड़े से पहले नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप सील करें।
   4. एक समय में केवल एक जोड़ी स्लाइड तैयार करें। यह सुनिश्चित करेगा एनआर इमेजिंग नमूनों में स्थिर रहता है । एनआर-दाग छवियों की गुणवत्ता 6 घंटे के बाद घटती है। असतत लिपिड बूंदों का निरीक्षण करना मुश्किल होता है और पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस बढ़ जाती है, जो एनआर सिग्नल डिटेक्शन में हस्तक्षेप करती है।
6. एनआर-दाग वाले कीड़े की इमेजिंग
   1. देखने के क्षेत्र के प्रति कई जानवरों पर कब्जा करने के लिए 5X आवर्धन पर कीड़े छवि ।
   2. व्यक्तिगत कीड़े के बेहतर मात्राकरण के लिए 10X आवर्धन पर स्विच करें।
   3. एनआर-दाग वाले कीड़े की छवि के लिए FITC/GFP चैनल का उपयोग करें और मात्राकरण के लिए इष्टतम शर्तों को निर्धारित करने के लिए अलग-अलग एक्सपोजर समय का प्रयास करें।
   4. संपीड़न के कारण डेटा खोने से बचने के लिए टीआईएफ प्रारूप में फ़ाइलों को सहेजें।
      नोट: विशिष्ट एक्सपोजर समय 100-1000 एमएस से लेकर। एक इष्टतम जोखिम समय होने के बाद, इमेजिंग स्थिरता बनाए रखने के लिए सभी नमूनों के लिए इसका उपयोग करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator