הנילוס אדום כתמים של C. elegans: שיטה לדמיין טיפות השומנים בבעלי חיים קבועים

Overview

סרטון זה מתאר פרוטוקול להכתים שומנים בתולעים שלמות וקבועות באמצעות צבע אדום הנילוס.  כדי להציג באופן ספציפי את השומנים ניטרלי בליבת טיפות השומנים, תמונה ספקטרום הפליטה הירוקה של מוכתם C. elegans.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Escorcia ואח ',כימות של שפע השומנים והערכה של התפלגות השומנים ב Caenorhabditis elegans על ידי הנילוס אדום ושמן אדום O כתמים, J. Vis. Exp. (2018).

1. הנילוס האדום (NR) כתמים של שומנים

1. הכנת 5 מ"ג / מ"ל NR פתרון מלאי
   1. בבקבוק 500 מ"ל, להוסיף 100 מ"ג של אבקת NR ל 200 מ"ל של 100% אצטון.
   2. מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
   3. לפני השימוש, מערבבים את הפתרון במשך 2 שעות בחושך.
   4. לשימוש ארוך טווח, יש לאחסן את תמיסת מלאי ה-NR בבקבוק אטום היטב ללא כל חשיפה לאור. קנה מידה NR פתרון מלאי על פי צרכי המחקר. ודא שאותו פתרון מלאי משמש בניסויים מכתמי NR כדי להשיג תוצאות צביעה והדמיה עקביות.
2. הכנת פתרון עבודה NR
   1. עבור כל 1 מ"ל של 40% isopropanol (v / v), להוסיף 6 μL של פתרון מניית NR.
   2. הכן 600 μL של פתרון עבודה NR עבור כל מדגם.
      שים לב: הפוך פתרון עבודה NR טרי ממש לפני הכתמת. בהתאם לצרכי פתרון מלאי NR, השתמש בצינור חרוט בוגר 15 מ"ל או 50 מ"ל.
3. הכנת תולעים עבור כתמי שומנים NR
   1. לגדל תולעים לשלב L4 מוקדם ב 20 °C (70 °F) על נמטודה צמיחה בינונית (NGM) זרעים עם מאוחר יומן OP50 E. coli.
   2. לשטוף את התולעים מהצלחת עם 1 מ"ל של 1x פוספט אגירה מלוחים + 0.01% טריטון X-100 (PBST) פתרון ולשים את התולעת השעיה בצינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל.
   3. צנטריפוגה התולעים ב 560 x g במשך 1 דקות. הסר את supernatant ולחזור על שלב זה עד E. coli מנוקה מהשעיה.
   4. מוסיפים 100 μL של 40% isopropanol לכדור התולעת ומדגרים אותו בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
   5. צנטריפוגה התולעים ב 560 x g במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant מבלי לשבש את גלולת התולעת.
      שים לב: השתמש בכמויות גבוהות יותר של PBST כדי לשטוף את התולעים את הצלחות אם באמצעות לוחות גדולים יותר או מכתים תולעים יותר לכל צלחת. אין לשטוף את התולעים ב- PBST יותר מ- 15 דקות לפני הקיבעון לדוגמה. בצע שטיפות נוספות אם supernatant אינו נקי של חיידקים. בצע את הדגירה ב 40% isopropanol באמצעות מאגוז או נדנדה. תמיד לפקח על הצינורות כדי לוודא תסיסה מדגם מלא מתרחשת.
4. כתמי שומנים עם NR
   1. בחושך, להוסיף 600 μL של פתרון עבודה NR לכל מדגם. הפוך את הצינורות שלוש פעמים וערבב באופן מלא את התולעים בתמיסת NR.
   2. לסובב את המדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.
   3. בעקבות הדגירה, צנטריפוגה התולעים ב 560 x g במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant.
   4. הוסף 600 μL של PBST ו הדגירה את הדגימות בחושך במשך 30 דקות כדי להסיר כתם NR עודף.
   5. צנטריפוגה הדגימות ב 560 x g במשך 1 דקות ולהסיר את כל אבל כ 50 μL של supernatant.
      שים לב: דגירה NR אינה דורשת עצבנות. התיישבות של תולעים נפוצה במהלך שלב זה.
5. הכנת שקופיות להדמיית מיקרוסקופ
   1. תחדש את גלולת התולעת בסופרנאטנט שנותר.
   2. מניחים 5 μL של השעיית תולעת על שקופית מיקרוסקופ ולשים כיסוי על בזהירות, כדי למנוע לכידת כל בועות אוויר.
   3. לאטום את הכיסוי עם לק לפני הדמיה תולעים.
   4. הכן רק כמה שקופיות בכל פעם. פעולה זו תבטיח הדמיית NR נשאר קבוע על פני דגימות. האיכות של תמונות מוכתמות NR פוחתת לאחר 6 שעות. טיפות השומנים דיסקרטיות קשה להתבונן פלואורסצנטיות רקע עולה, אשר מפריע זיהוי אותות NR.
6. הדמיה של תולעים מוכתמות ב-NR
   1. צלם את התולעים בהגדלה פי 5 כדי ללכוד מספר בעלי חיים בכל שדה ראייה.
   2. עבור להגדלה פי 10 לכימות טוב יותר של תולעים בודדות.
   3. השתמש בערוץ FITC/GFP כדי לדמות תולעים מוכתמות NR ולנסות זמני חשיפה שונים כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לכימות.
   4. שמור קבצים בתבנית TIF כדי למנוע אובדן נתונים עקב דחיסה.
      שים לב: זמני החשיפה האופייניים נעים בין 100-1000 אלפיות השנייה. לאחר זמן חשיפה אופטימלי, השתמש בו עבור כל הדגימות כדי לשמור על עקביות הדמיה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator