Нил Красное окрашивание C. elegans: Метод визуализации липидных капель в фиксированных животных

Overview

Это видео описывает протокол для окрашивания липидов в целом, фиксированные черви с помощью Нила Красный краситель.  Для конкретного просмотра нейтральных липидов в ядре липидных капель, изображение зеленых спектров излучения окрашенных C. elegans.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Escorcia и др.,количественная оценка липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нил красный и масло красного O окрашивания, J. Vis. Exp. (2018).

1. Нил Красный (NR) Окрашивание липидов

1. Приготовление раствора бульона NR 5 мг/мл
   1. В бутылке 500 мл добавьте 100 мг порошка NR до 200 мл 100% ацетона.
   2. Обложка бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
   3. Перед использованием, перемешать раствор в течение 2 ч в темноте.
   4. Для длительного использования храните раствор NR в плотно запечатанной бутылке без какого-либо воздействия света. Масштаб NR фондового решения в соответствии с потребностями исследований. Убедитесь, что одно и то же решение фонда используется в экспериментах по окрашиваниям NR для получения последовательных результатов окрашивания и визуализации.
2. Подготовка рабочего решения NR
   1. На каждые 1 мл 40% изопропанола (v/v) добавьте 6 л раствора NR.
   2. Подготовь для каждого образца 600 л рабочего решения NR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать свежие NR рабочее решение прямо перед окрашивание. В зависимости от потребностей NR фондовый раствор, использовать либо 15 мл или 50 мл окончил конической трубки.
3. Подготовка червей для окрашивания липидов NR
   1. Выращиваем червей до ранней стадии L4 при 20 градусах цельсия на среде роста нематод (NGM), посеянной с поздней регистрацией OP50 E. coli.
   2. Вымойте червей с пластины с 1 мл 1x фосфат-буферного солевого раствора 0,01% Triton X-100 (PBST) решение и положить червь подвески в 1,5 мл микрофьюдж трубки.
   3. Центрифуга червей на 560 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант и повторите этот шаг до тех пор, пока кишечная палочка не будет очищена от подвески.
   4. Добавьте 100 МКЛ из 40% изопропанола в гранулы червя и инкубировать его при комнатной температуре в течение 3 минут.
   5. Центрифуга червей на 560 х г в течение 1 мин и удалить супернатант, не нарушая червя гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте большие объемы PBST для мытья червей с пластин при использовании больших пластин или окрашивания больше червей на тарелку. Не мыть червей в PBST более чем за 15 минут до фиксации образца. Выполните дополнительные моет, если супернатант не очищается от бактерий. Проведение инкубации в 40% изопропанола с помощью гайки или рокера. Всегда следите за трубками, чтобы убедиться, что полный образец агитации происходит.
4. Липидное окрашивание с NR
   1. В темноте добавьте 600 л рабочего решения NR к каждому образцу. Переверните трубки три раза и полностью смешайте червей в растворе NR.
   2. Поверните образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
   3. После инкубации центрифуга червей на 560 х г в течение 1 мин и удалить супернатант.
   4. Добавьте 600 л PBST и инкубировать образцы в темноте в течение 30 минут, чтобы удалить избыток пятна NR.
   5. Центрифуга образцов на 560 х г в течение 1 мин и удалить все, кроме примерно 50 йл супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация NR не требует агитации. Урегулирование червей является общим во время этого шага.
5. Подготовка слайдов для визуализации микроскопа
   1. Resuspend червя гранулы в оставшихся supernatant.
   2. Поместите 5 МКЛ червя подвески на слайд микроскопа и положить крышку на тщательно, чтобы избежать захвата любых пузырьков воздуха.
   3. Печать крышки с лаком для ногтей до изображения червей.
   4. Подготовьтесь только пару слайдов за один раз. Это гарантирует, что NR-изображение остается постоянным в разных образцах. Качество NR-окрашенных изображений уменьшается после 6 часов. Дискретные липидные капли трудно наблюдать и фоновая флуоресценция увеличивается, что препятствует обнаружению сигнала NR.
6. Изображение червей, окрашенных NR
   1. Изображение червей при увеличении 5X для захвата нескольких животных на поле зрения.
   2. Переключитесь на увеличение 10X для лучшей количественной оценки отдельных червей.
   3. Используйте канал FITC/GFP для изображения червей, окрашенных NR, и попробуйте разное время экспозиции, чтобы определить оптимальные условия для количественной оценки.
   4. Сохранить файлы в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное время экспозиции варьируется от 100-1000 мс. Имея оптимальное время экспозиции, используйте его для всех образцов для поддержания согласованности изображений.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator