C.エレガンスのナイルレッド染色 : 固定動物の脂質滴を可視化する方法

Overview

このビデオでは、Nile Red dyeを使用して、固定されたワーム全体で脂質を染色するプロトコルについて説明します。 脂質液滴のコアに中性脂質を具体的に見るには、染色されたC.エレガンスの緑色発光スペクトルを画像化する。

Protocol

このプロトコルは、Escorcia らからの抜粋であり、ナイルレッドとオイルレッドO染色による ケノハブディティス・エレガンス における脂質の豊富量の定量化および脂質分布の評価 、J.Vis. Exp. (2018)

1. ナイルレッド(NR)脂質の染色

1. 5 mg/mL NR ストック溶液の調製
   1. 500 mL ボトルに、100% アセトンの 200 mL に NR 粉末 100 mg を加えます。
   2. 光への暴露を避けるために、ボトルをアルミホイルで覆います。
   3. 使用前に、溶液を暗闇の中で2時間かき混ぜます。
   4. 長期使用のために、NRストック溶液を、光を露出することなく密閉したボトルに保管してください。研究ニーズに応じてNRストックソリューションを拡大縮小します。NR染色実験で同じストックソリューションを使用して、一貫した染色結果とイメージング結果を得られるようにします。
2. NRワーキングソリューションの調製
   1. 40%イソプロパノール(v/v)の1 mLごとに、6 μLのNRストック溶液を追加します。
   2. 各サンプルに対して600 μLのNR動作溶液を用意します。
      注: 染色の直前に新鮮なNR作業ソリューションを作ります。NRストック溶液のニーズに応じて、15 mLまたは50 mLの段階的な円錐管を使用してください。
3. NR脂質染色用のワームの調製
   1. ネマトード成長培地(NGM)に20°Cで早期L4段階にワームを成長させる後期ログOP50 大腸菌を播種する。
   2. 1xリン酸緩衝生理食塩水+ 0.01%トリトンX-100(PBST)溶液の1 mLでワームをプレートから洗い流し、ワーム懸濁液を1.5 mLマイクロフュージチューブに入れます。
   3. 560 x g で 1 分間の遠心分離機。上清を取り除き、 大腸菌 が懸濁液から取り除かれるまでこのステップを繰り返します。
   4. ワームペレットに40%のイソプロパノールの100 μLを加え、室温で3分間インキュベートします。
   5. 560 x g で 1 分間のワームを遠心分離し、ワームペレットを破壊することなく上清を除去します。
      注: より大きなプレートを使用する場合や、プレート当たりの多くのワームを染色する場合は、より大量のPBSTを使用して、ワームをプレートから洗い流してください。サンプル固定の15分以上前にPBSTでワームを洗浄しないでください。上清が細菌を取り除かない場合は、追加のすきを行います。ヌテネーターまたはロッカーを使用して40%イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプル攪拌が起きることを確認するために、常にチューブを監視します。
4. NRによる脂質染色
   1. 暗闇の中で、各サンプルに600 μLのNRワーキングソリューションを加えます。チューブを3回反転し、NR溶液中のワームを完全に混合します。
   2. 室温で暗い部分でサンプルを2時間回転させます。
   3. インキュベーションに続いて、ワームを560 x g で1分間遠心し、上清を取り除く。
   4. 600 μLのPBSTを加え、試料を暗闇の中で30分間インキュベートして、余分なNR染色を除去します。
   5. サンプルを560 x g で1分間遠心し、約50μLの上清を除いて全て除去します。
      注: NRインキュベーションは攪拌を必要としない。ワームのセトリングは、このステップで一般的です。
5. 顕微鏡イメージング用スライドの作成
   1. ウォームペレットを残りの上清に再び懸濁させる。
   2. 5 μLのウォームサスペンションを顕微鏡スライドに置き、気泡がトラップされないように慎重にカバースリップを置きます。
   3. ワームをイメージングする前にマニキュアでカバースリップを密封してください。
   4. 一度にスライドを 2 枚だけ準備します。これにより、NRイメージングはサンプル間で一定に保ち続ける。NR染色画像の品質は6時間後に減少します。離散脂質滴は観察が困難であり、バックグラウンド蛍光が増加し、NRシグナル検出を妨げる。
6. NR染色されたワームのイメージング
   1. 5倍の倍率でワームを画像化し、視野ごとに複数の動物を捕獲します。
   2. 個々のワームの定量化を改善するために10倍の倍率に切り替えます。
   3. FITC/GFPチャネルを使用してNR染色されたワームを画像化し、異なる暴露時間を試して定量に最適な条件を決定します。
   4. 圧縮によるデータの損失を避けるために、TIF 形式でファイルを保存します。
      注: 典型的な暴露時間は100-1000 msの範囲である。最適な露光時間を持って、イメージングの一貫性を維持するために、すべてのサンプルのためにそれを使用します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator