Colorazione rossa del Nilo di C. elegans: Un metodo per visualizzare le goccioline lipidiche negli animali fissi

Overview

Questo video descrive un protocollo per macchiare i lipidi in interi vermi fissi usando colorante rosso del Nilo.  Per visualizzare specificamente i lipidi neutri nel nucleo delle goccioline lipidiche, immagini gli spettri di emissione verde degli elegani C. macchiati.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Escorcia et al, Quantificazione dell'abbondanza lipidica e valutazione della distribuzione lipidica in Caenorhabditis elegans di Nile Red e Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Colorazione dei lipidi rosso nilo (NR)

1. Preparazione della soluzione stock di NR da 5 mg/mL
   1. In una bottiglia da 500 ml, aggiungere 100 mg di polvere NR a 200 ml di acetone al 100%.
   2. Coprire la bottiglia con un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce.
   3. Prima dell'uso, mescolare la soluzione per 2 ore al buio.
   4. Per un uso a lungo termine, conservare la soluzione stock NR in una bottiglia ben sigillata senza alcuna esposizione alla luce. Scalare la soluzione stock NR in base alle esigenze di ricerca. Assicurarsi che la stessa soluzione stock sia utilizzata in tutti gli esperimenti di colorazione NR per ottenere risultati di colorazione e imaging coerenti.
2. Preparazione della soluzione di lavoro NR
   1. Per ogni 1 mL del 40% di isopropanolo (v/v), aggiungere 6 μL di soluzione stock NR.
   2. Preparare 600 μL di soluzione di lavoro NR per ciascun campione.
      NOTA: Crea una soluzione di lavoro NR fresca subito prima della colorazione. A seconda delle esigenze della soluzione stock NR, utilizzare un tubo conico graduato da 15 ml o 50 ml.
3. Preparazione di vermi per la colorazione lipidica NR
   1. Coltivare vermi fino all'inizio dello stadio L4 a 20 °C su mezzo di crescita del nematode (NGM) seminato con OP50 E. coli a log tardivo.
   2. Lavare i vermi dalla piastra con 1 ml di soluzione salina tamponata da fosfati + 0,01% tritone X-100 (PBST) e mettere la sospensione del verme in un tubo di microfugo da 1,5 ml.
   3. Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min. Rimuovere il supernatante e ripetere questo passaggio fino a quando E. coli non viene eliminato dalla sospensione.
   4. Aggiungere 100 μL di isopropanolo al pellet di verme e incubarlo a temperatura ambiente per 3 minuti.
   5. Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 minuto e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet di verme.
      NOTA: Utilizzare volumi più elevati di PBST per lavare i vermi dalle piastre se si utilizzano piastre più grandi o si macchiano più vermi per piastra. Non lavare i vermi in PBST più di 15 minuti prima della fissazione del campione. Eseguire lavaggi aggiuntivi se il supernatante non viene eliminato dai batteri. Effettuare l'incubazione in isopropanolo al 40% utilizzando un nutatore o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi che si verifichi un'agitazione completa del campione.
4. Colorazione lipidica con NR
   1. Al buio, aggiungere 600 μL di soluzione di lavoro NR a ciascun campione. Invertire i tubi tre volte e mescolare completamente i vermi in soluzione NR.
   2. Ruotare il campione al buio a temperatura ambiente per 2 ore.
   3. Dopo l'incubazione, centrifugare i vermi a 560 x g per 1 minuto e rimuovere il supernatante.
   4. Aggiungere 600 μL di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti per rimuovere la macchia NR in eccesso.
   5. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min e rimuovere tutti tranne circa 50 μL di supernatante.
      NOTA: L'incubazione NR non richiede agitazione. La sedimentazione dei vermi è comune durante questo passaggio.
5. Preparazione di diapositive per l'imaging al microscopio
   1. Rimescolare il pellet di verme nel supernatante rimanente.
   2. Posizionare 5 μL di sospensione del verme su uno scivolo al microscopio e indossare con cura un coverslip per evitare di intrappolare eventuali bolle d'aria.
   3. Sigillare il coverslip con smalto per unghie prima di immaginare i vermi.
   4. Preparare solo un paio di diapositive alla volta. Ciò garantirà che l'imaging NR rimanga costante tra i campioni. La qualità delle immagini macchiate di NR diminuisce dopo 6 ore. Le goccioline lipidiche discrete sono difficili da osservare e la fluorescenza di fondo aumenta, il che interferisce con il rilevamento del segnale NR.
6. Imaging di vermi macchiati di NR
   1. Immagine dei vermi con ingrandimento 5X per catturare diversi animali per campo visivo.
   2. Passare all'ingrandimento 10X per una migliore quantificazione dei singoli worm.
   3. Utilizzare il canale FITC/GFP per immaginire worm macchiati di NR e provare diversi tempi di esposizione per determinare le condizioni ottimali per la quantificazione.
   4. Salvare i file in formato TIF per evitare di perdere dati a causa della compressione.
      NOTA: I tempi di esposizione tipici vanno da 100-1000 ms. Avendo un tempo di esposizione ottimale, usalo per tutti i campioni per mantenere la coerenza dell'imaging.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator