Nil rød farvning af C. elegans: En metode til at visualisere Lipid dråber i faste dyr

Overview

Denne video beskriver en protokol til at plette lipider i hele, faste orme ved hjælp af Nilen Rød farvestof.  For specifikt at se de neutrale lipider i kernen af lipiddråber, skal du forestille dig de grønne emissionsspektre af de farvede C. elegans.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Escorcia et al., Kvantificering af Lipid Abundance og evaluering af Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans af Nile Red og Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Nilen Rød (NR) Farvning af Lipids

1. Præparat af 5 mg/mL NR-stamopløsning
   1. I en 500 ml flaske tilsættes 100 mg NR-pulver til 200 ml 100% acetone.
   2. Dæk flasken med aluminiumsfolie for at undgå enhver udsættelse for lys.
   3. Før brug omrøres opløsningen i 2 timer i mørke.
   4. Til langvarig brug opbevares NR-lageropløsningen i en tæt forseglet flaske uden lyseksponering. Scale NR lagerløsning i henhold til forskningsbehov. Sørg for, at den samme stamopløsning anvendes på tværs af NR-farvningseksperimenter for at opnå ensartede farvnings- og billeddannelsesresultater.
2. Forberedelse af NR's arbejdsløsning
   1. For hver 1 ml isopropanol (v/v) tilsættes 6 μL NR-stamopløsning.
   2. Der fremstilles 600 μL NR-arbejdsopløsning til hver prøve.
      BEMÆRK: Lav en frisk NR-arbejdsløsning lige før farvning. Afhængigt af NR lagerløsning behov, skal du bruge enten en 15 ml eller 50 ml gradueret konisk rør.
3. Forberedelse af orme til NR lipid farvning
   1. Orme vokses til det tidlige L4-stadie ved 20 °C på nematodevækstmedium (NGM), seedet med sen-log OP50 E. coli.
   2. Ormene vaskes af pladen med 1 ml 1x fosfatbufferet saltvand + 0,01% Triton X-100 (PBST) opløsning og sæt ormeaffjedringen i et 1,5 ml mikrofugerør.
   3. Centrifuge ormene ved 560 x g i 1 min. Fjern supernatanten, og gentag dette trin, indtil E. coli er fjernet fra suspensionen.
   4. Der tilsættes 100 μL 40% isopropanol til ormepillen, og den inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
   5. Centrifuge ormene på 560 x g i 1 min og fjern supernatanten uden at forstyrre ormepillen.
      BEMÆRK: Brug større mængder PBST til at vaske ormene af pladerne, hvis du bruger større plader eller pletter flere orme pr. plade. Ormene må ikke vaskes i PBST mere end 15 minutter før prøvefikseringen. Udfør yderligere vasker, hvis supernatanten ikke ryddes for bakterier. Inkubationen udføres i 40% isopropanol ved hjælp af en nutator eller rocker. Overvåg altid rørene for at sikre, at der opstår fuld prøveomrørelse.
4. Lipid farvning med NR
   1. I mørke tilsættes 600 μL NR-arbejdsopløsning til hver prøve. Vend rørene tre gange og bland ormene fuldt ud i NR-opløsning.
   2. Prøven roteres i mørke ved stuetemperatur i 2 timer.
   3. Efter inkubationen centrifuge ormene ved 560 x g i 1 min og fjern supernatanten.
   4. Der tilsættes 600 μL PBST, og prøverne inkuberes i mørke i 30 minutter for at fjerne overskydende NR-pletten.
   5. Prøverne centrifuges ved 560 x g i 1 min. og alle, men ca. 50 μL supernatant, fjernes.
      BEMÆRK: NR inkubation kræver ikke agitation. Afregning af orme er almindeligt under dette trin.
5. Forberedelse af lysbilleder til mikroskopbilleddannelse
   1. Genbrug ormen pellet i de resterende supernatant.
   2. Placer 5 μL ormeaffjedring på et mikroskop dias og sætte en coverlip på omhyggeligt for at undgå fældefangst nogen luftbobler.
   3. Forsegl coverlip med neglelak før billeddiagnostik orme.
   4. Forbered kun et par dias ad gangen. Dette vil sikre, at NR-billeddannelse forbliver konstant på tværs af prøver. Kvaliteten af NR-farvede billeder aftager efter 6 timer. Diskrete lipiddråber er vanskelige at observere, og baggrundsfluorescens øges, hvilket forstyrrer NR-signaldetektering.
6. Billeddannelse af NR-farvede orme
   1. Billede ormene ved 5X forstørrelse for at fange flere dyr pr synsfelt.
   2. Skift til 10X forstørrelse for bedre kvantificering af individuelle orme.
   3. Brug FITC/GFP-kanal til at afbilde NR-farvede orme, og prøv forskellige eksponeringstider for at bestemme de optimale betingelser for kvantificering.
   4. Gem filer i TIF-format for at undgå at miste data på grund af komprimering.
      BEMÆRK: Typiske eksponeringstider varierer fra 100-1000 ms. Med en optimal eksponeringstid skal du bruge den til alle prøver for at opretholde billedkonsistens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator