尼罗河红染色 C. elegans： 固定动物脂质液滴可视化的方法

Overview

此视频描述了使用尼罗河红染料对整个固定蠕虫进行污渍的方案。 要特别查看脂质液滴核心的中性脂质，请映像染色的C. elegans的绿色排放光谱。

Protocol

本协议摘自Escorcia等人的摘录，《脂质丰度量化》和《尼罗河红和油红O染色剂（2018年）》对卡诺哈布迪炎中脂质分布的评价。

1. 尼罗河红 （NR） 脂质染色

1. 准备 5 毫克/mL NR 库存解决方案
   1. 在 500 mL 瓶中，将 100 毫克 NR 粉末添加到 200 mL 中，即 100% Acetone。
   2. 用铝箔盖住瓶子，避免暴露在光线下。
   3. 使用前，在黑暗中搅拌溶液2小时。
   4. 对于长期使用，将 NR 库存溶液存放在密封紧密的瓶子中，无需任何光线照射。根据研究需求扩展 NR 库存解决方案。确保在 NR 染色实验中使用相同的库存解决方案，以获得一致的染色和成像结果。
2. NR 工作解决方案的准备
   1. 每 1 mL 的 40% 异丙帕诺 （v/v）， 添加 6 μL 的 NR 库存解决方案。
   2. 为每个样本准备 600 μL 的 NR 工作解决方案。
      注： 在染色前立即制作新的 NR 工作解决方案。根据 NR 库存解决方案的需要，使用 15 mL 或 50 mL 分级圆锥管。
3. 为 NR 脂质染色准备蠕虫
   1. 在线虫生长介质 （NGM） 上将蠕虫生长到 20 °C 的早期 L4 阶段，并配以晚日志 OP50 大肠杆菌。
   2. 用 1mL 的磷酸盐缓冲盐水 + 0.01% Triton X-100 （PBST） 溶液将蠕虫从盘子中洗掉，并将蠕虫悬架放入 1.5 mL 微胶管中。
   3. 在560 x g 下将蠕虫离心1分钟。取出超自然，重复此步骤，直到 大肠杆菌 从悬架中清除。
   4. 在蠕虫颗粒中加入 100 μL 的 40% 异丙酚，并在室温下孵育 3 分钟。
   5. 以 560 x g 的速度将蠕虫离心 1 分钟，并在不破坏蠕虫颗粒的情况下去除超自然物。
      注： 如果使用较大的板或每板染色更多的蠕虫，则使用更大量的 PBST 来洗掉板上的蠕虫。在样品固定前 15 分钟以上不要在 PBST 中清洗蠕虫。如果超自然物未清除细菌，则执行额外的洗涤。使用螺母或摇动器在 40% 异丙酚中进行孵育。始终监控管子，以确保发生完整的样本搅拌。
4. 脂质染色与NR
   1. 在黑暗中，向每个示例添加 600 μL 的 NR 工作解决方案。将管子倒置三次，并将蠕虫完全混合在 NR 溶液中。
   2. 在室温下在黑暗中旋转样品2小时。
   3. 孵化后，将蠕虫在 560 x g 中离心 1 分钟，并去除超自然物。
   4. 加入 600 μL 的 PBST，在黑暗中孵化样品 30 分钟，以去除多余的 NR 污渍。
   5. 以 560 x g 的速度将样品离心 1 分钟，除约 50μL 的超自然人之外，其余样品均取出。
      注： NR孵化不需要搅拌。在此步骤中，蠕虫的沉降很常见。
5. 为显微镜成像准备幻灯片
   1. 将蠕虫颗粒重新喷入剩余的超自然物中。
   2. 将 5 μL 的蠕虫悬架放在显微镜滑梯上，并小心地将盖片放在上面，以避免捕获任何气泡。
   3. 在成像蠕虫之前，用指甲油密封盖片。
   4. 一次只准备几张幻灯片。这将确保整个样品的 NR 成像保持不变。NR 染色图像的质量在 6 小时后降低。分离的脂质液滴难以观察，背景荧光增加，干扰 NR 信号检测。
6. NR 染色蠕虫的成像
   1. 以 5 倍的放大倍数对蠕虫进行成像，以捕获每个视场中的几只动物。
   2. 切换到 10 倍放大倍数，以便更好地量化单个蠕虫。
   3. 使用 FITC/GFP 通道对 NR 染色的蠕虫进行成像，并尝试不同的暴露时间以确定量化的最佳条件。
   4. 以 TIF 格式保存文件，以避免因压缩而丢失数据。
      注： 典型曝光时间从100-1000毫秒不等。拥有最佳的曝光时间，将其用于所有样品以保持成像一致性。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator