Coloration rouge du Nil de C. elegans: Une méthode pour visualiser les gouttelettes lipidiques chez les animaux fixes

Overview

Cette vidéo décrit un protocole pour tacher les lipides dans des vers entiers et fixes à l’aide du colorant rouge du Nil.  Pour afficher spécifiquement les lipides neutres dans le noyau des gouttelettes lipidiques, imagez les spectres d’émission verte du C. elegans taché.

Protocol

Ce protocole est un extrait d’Escorcia et coll.,Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans par Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Tache rouge du Nil (NR) des lipides

1. Préparation d’une solution de stock NR de 5 mg/mL
   1. Dans une bouteille de 500 ml, ajouter 100 mg de poudre de NR à 200 ml d’acétone à 100 %.
   2. Couvrir la bouteille de papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
   3. Avant l’utilisation, remuer la solution pendant 2 h dans l’obscurité.
   4. Pour une utilisation à long terme, conservez la solution de stock NR dans une bouteille hermétiquement scellée sans exposition à la lumière. Échelle nr stock solution en fonction des besoins de recherche. Assurez-vous que la même solution de stock est utilisée dans le cas d’expériences de coloration NR pour obtenir des résultats cohérents en tacher et en imagerie.
2. Préparation de la solution de travail NR
   1. Pour chaque 1 mL de 40% d’isopropanol (v/v), ajouter 6 μL de solution de stock NR.
   2. Préparez 600 μL de solution de travail NR pour chaque échantillon.
      REMARQUE: Faites la solution fraîche de travail de NR juste avant la coloration. Selon les besoins de solution de stock NR, utilisez soit un tube conique gradué de 15 mL ou 50 mL.
3. Préparation des vers pour la coloration des lipides NR
   1. Faire pousser les vers au stade L4 précoce à 20 °C sur le milieu de croissance des nématodes (MNR) ensemencé avec op50 E. coli à grumes tardives.
   2. Lavez les vers de la plaque avec 1 mL de solution saline 1x tamponnée de phosphate + 0,01% triton X-100 (PBST) solution et mettez la suspension de ver dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
   3. Centrifugeuse les vers à 560 x g pendant 1 min. Retirez le surnatant et répétez cette étape jusqu’à ce que E. coli soit dégagé de la suspension.
   4. Ajouter 100 μL de 40% d’isopropanol à la pastille de ver et l’incuber à température ambiante pendant 3 min.
   5. Centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et enlever le supernatant sans perturber la pastille de ver.
      REMARQUE: Utilisez des volumes plus élevés de PBST pour laver les vers des plaques si vous utilisez de plus grandes plaques ou si vous colorez plus de vers par plaque. Ne pas laver les vers dans PBST plus de 15 minutes avant la fixation de l’échantillon. Effectuez des lavages supplémentaires si le surnatant n’est pas dégagé des bactéries. Effectuer l’incubation à 40% d’isopropanol à l’aide d’un nutator ou d’un rocker. Surveillez toujours les tubes pour vous assurer que l’agitation complète de l’échantillon se produit.
4. Coloration lipidique avec NR
   1. Dans l’obscurité, ajouter 600 μL de solution de travail NR à chaque échantillon. Inverser les tubes trois fois et mélanger complètement les vers dans la solution NR.
   2. Faites pivoter l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.
   3. Après l’incubation, centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et enlever le surnatant.
   4. Ajouter 600 μL de PBST et incuber les échantillons dans l’obscurité pendant 30 min pour éliminer l’excès de tache NR.
   5. Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et enlever tous sauf environ 50 μL de supernatant.
      REMARQUE: L’incubation NR ne nécessite pas d’agitation. Le règlement des vers est fréquent au cours de cette étape.
5. Préparation de diapositives pour l’imagerie au microscope
   1. Resuspendez la pastille de ver en restant supernatant.
   2. Placez 5 μL de suspension de ver sur une lame de microscope et mettez soigneusement un couvercle pour éviter de piéger les bulles d’air.
   3. Sceller le coverslip avec du vernis à ongles avant d’imaginer les vers.
   4. Préparez seulement quelques diapositives à la fois. Cela permettra de s’assurer que l’imagerie NR reste constante dans tous les échantillons. La qualité des images teintées de NR diminue après 6 h. Les gouttelettes lipidiques discrètes sont difficiles à observer et la fluorescence de fond augmente, ce qui interfère avec la détection du signal NR.
6. Imagerie des vers tachés de NR
   1. Imagez les vers au grossissement 5X pour capturer plusieurs animaux par champ de vision.
   2. Passez au grossissement 10X pour une meilleure quantification des vers individuels.
   3. Utilisez le canal FITC/GFP pour imager les vers tachés de NR et essayez différents temps d’exposition pour déterminer les conditions optimales de quantification.
   4. Enregistrez des fichiers en format TIF pour éviter de perdre des données dues à la compression.
      REMARQUE: Les temps d’exposition typiques varient de 100-1000 ms. Ayant un temps d’exposition optimal, utilisez-le pour tous les échantillons afin de maintenir la cohérence de l’imagerie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator