Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Nilen rød farging av C. elegans: En metode for å visualisere Lipiddråper i faste dyr

Overview

Denne videoen beskriver en protokoll for å flekke lipider i hele, faste ormer ved hjelp av Nilen Rød fargestoff.  For å spesifikt se de nøytrale lipidene i kjernen av lipiddråper, kan du se for deg det grønne utslippsspektraet til de fargede C. eleganene.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Nil rød (NR) Farging av lipider

  1. Tilberedning av 5 mg/ml NR-lagerløsning
    1. I en 500 ml flaske tilsettes 100 mg NR-pulver til 200 ml 100 % aceton.
    2. Dekk flasken med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys.
    3. Rør oppløsningen i 2 timer i mørket før bruk.
    4. Oppbevar NR-lagerløsningen på lang sikt i en tett forseglet flaske uten lyseksponering. Skaler NR-lagerløsningen etter forskningsbehov. Sørg for at den samme lagerløsningen brukes på tvers av NR-fargeeksperimenter for å oppnå konsistente farge- og bilderesultater.
  2. Utarbeidelse av NR arbeidsløsning
    1. For hver 1 ml 40 % isopropanol (v/v) tilsett 6 μL NR-lagerløsning.
    2. Forbered 600 μL NR-arbeidsløsning for hver prøve.
      MERK: Lag fersk NR-arbeidsløsning rett før farging. Avhengig av NR-lagerløsningsbehov, bruk enten et 15 ml eller 50 ml gradert konisk rør.
  3. Fremstilling av ormer for NR lipidfarging
    1. Vokse ormer til tidlig L4 stadium ved 20 °C på nematode vekst medium (NGM) frø med sen-logg OP50 E. coli.
    2. Vask ormene av platen med 1 ml 1x fosfatbufret saltvann + 0,01% Triton X-100 (PBST) løsning og legg ormeopphenget i et 1,5 ml mikrofugerør.
    3. Sentrifuger ormene på 560 x g i 1 min. Fjern supernatanten og gjenta dette trinnet til E. coli er fjernet fra suspensjon.
    4. Tilsett 100 μL 40% isopropanol til ormepellet og inkuber den ved romtemperatur i 3 min.
    5. Sentrifuger ormene på 560 x g i 1 min og fjern supernatanten uten å forstyrre ormepellet.
      MERK: Bruk høyere volumer av PBST for å vaske ormene av platene hvis du bruker større plater eller flekker flere ormer per plate. Ikke vask ormene i PBST mer enn 15 minutter før prøvefikseringen. Utfør ekstra vasker hvis supernatanten ikke er ryddet av bakterier. Utfør inkubasjonen i 40% isopropanol ved hjelp av en mutter eller rocker. Overvåk alltid rørene for å sikre at full prøve agitasjon oppstår.
  4. Lipidfarging med NR
    1. I mørket legger du til 600 μL NR-arbeidsløsning i hver prøve. Snu rørene tre ganger og bland ormene helt i NR-oppløsning.
    2. Roter prøven i mørket ved romtemperatur i 2 timer.
    3. Etter inkubasjonen sentrifugerer du ormene på 560 x g i 1 min og fjerner supernatanten.
    4. Tilsett 600 μL PBST og inkuber prøvene i mørket i 30 min for å fjerne overflødig NR-flekk.
    5. Sentrifuger prøvene ved 560 x g i 1 min og fjern alle unntatt ca. 50 μL supernatant.
      MERK: NR-inkubasjon krever ikke agitasjon. Oppgjør av ormer er vanlig i dette trinnet.
  5. Forberedelse av lysbilder for mikroskopavbildning
    1. Resuspend ormepellet i gjenværende supernatant.
    2. Plasser 5 μL ormfjæring på et mikroskopsklie og sett på en deksleslip på forsiktig for å unngå å fange luftbobler.
    3. Forsegle dekslene med neglelakk før bildebehandling av ormer.
    4. Forbered bare et par lysbilder om gangen. Dette vil sikre at NR-avbildningen forblir konstant på tvers av prøver. Kvaliteten på NR-fargede bilder avtar etter 6 timer. Diskrete lipiddråper er vanskelige å observere og bakgrunnsfluorescens øker, noe som forstyrrer NR-signaldeteksjonen.
  6. Avbildning av NR-fargede ormer
    1. Bilde ormene med 5X forstørrelse for å fange flere dyr per synsfelt.
    2. Bytt til 10X forstørrelse for bedre kvantifisering av individuelle ormer.
    3. Bruk FITC/GFP-kanalen til å avbilde NR-fargede ormer og prøv forskjellige eksponeringstider for å bestemme de optimale betingelsene for kvantifisering.
    4. Lagre filer i TIF-format for å unngå å miste data på grunn av komprimering.
      MERK: Typiske eksponeringstider varierer fra 100-1000 ms. Hvis du har optimal eksponeringstid, bruker du den til alle prøver for å opprettholde bildekonsistensen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tom verdi Problem
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter