Overview
هنا، نصف تقنية تستخدم لتصور الحمض النووي الجينومي في الديدان الخيطية الثابتة وسليمة. يتضمن الفيديو بروتوكولا نموذجيا لحساب الكروماتين في البويضات غير المخصبة C. elegans.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من كلارك وآخرون، التلاعب في Ploidy في Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2018).
يمكن التحقق من صحة سلالات التترابلويد عن طريق حساب عدد الكروموسومات في البويضات غير المخصبة. يمكن استخدام المجهر الفلوري لفحص عدد أزواج الكروموسومات في البويضات ثنائية الدبلويد غير المخصبة (قبل الانقسامات المتوسطة) ، إذا كانت السلالة تحتوي على علامة فلورية للكروموسومات. في حالة عدم وجود علامات كروموسوم الفلورسنت، يمكن فحص الديدان الخيطية رباعية الأرجل عن طريق إصلاح الديدان الخيطية وتلطيخ مع صبغة الحمض النووي. انظر أدناه لبروتوكول لتحديد الإيثانول والحيوان كله 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole ديهيدروكلوريد (DAPI) تلطيخ.
الحيوان كله DAPI تلطيخ
ملاحظة: يمكن التحقق من صحة سلالات Tetraploid التي تحمل 12 زوجا من الكروموسومات المتصلة من خلال تلطيخ DAPI لهذه الحيوانات وحساب عدد أجسام DAPI في البويضات غير المخصبة.
- ضع 5 إلى 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 على شريحة المجهر ، ثم نقل 6 - 10 nematodes إلى القطرة.
- تحت المجهر تشريح، رسم معظم M9 من قطرة دون إزالة الديدان الخيطية مع أنسجة التنظيف خالية من الوبر. ثم، على الفور إضافة قطرة 10 ميكرولتر من الإيثانول 90٪ على الديدان. السماح للديدان لتجف تماما، ولكن لمدة لا تزيد عن بضع ثوان.
- بمجرد أن يتبخر الإيثانول (يمكن رؤية ذلك كما يحدث تحت المجهر التشريحي) ، أضف 10 ميكرولتر إضافية من الإيثانول بنسبة 90٪ على الديدان.
- كرر الخطوة 3.1.3 ثلاث مرات أخرى.
- بمجرد أن يتبخر آخر قطرة من الإيثانول ، أضف 6 ميكرولتر من صبغة DAPI أو Hoechst عند التركيز النهائي الموصى به في الوسائط المتصاعدة المفضلة (على سبيل المثال ، تخفيف 1:1000 من تركيز مخزون DAPI 2 نانوغرام / μL في M9). لتخزين طويل الأجل من الشرائح, 0.5٪ ف-phenylenediamine حل في 20 mM تريس-HCl, درجة الحموضة 8.8, في 90٪ الجلسرين كحل مضاد للفيد, بدلا من M9 فقط, يمكن استخدامها.
- تغطية الديدان على الشريحة مع غطاء وختم حواف غطاء مع طلاء الأظافر. النتيجة في المجهر مضان (الخطوة 3.1.7) على الأقل 10 دقيقة بعد إضافة coverslip. يمكن تخزين الشرائح بدون مضاد للضفميد لبضعة أيام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل التسجيل ، ولكن جودة الفلورسينس تبدأ في الانخفاض بعد بضعة أيام.
- باستخدام المجهر الفلوري في التكبير 100X، يسجل عدد من الهيئات DAPI واحد (يفترض أزواج كروموسوم واحد) في البويضات غير المخصبة الأكثر نضجا، والتي هي على الفور المتاخمة لالحيوانات المنوية ولم يدخل بعد spermatheca أو الرحم.
- لتسجيل أجسام DAPI الفردية داخل نواة البويضات ، استخدم التركيز الدقيق للمجهر للتحرك ببطء من أعلى نواة البويضات إلى الأسفل أثناء العد. ثم، سرد نفس النواة أثناء تحريك التركيز في الاتجاه المعاكس(أي،من أسفل إلى أعلى النواة) لتأكيد العدد المحصى لأجسام DAPI.
- تسجيل البويضات غير المخصبة الأكثر نضجا في كل من النواد اثنين في ما لا يقل عن عشرة hermaphrodites لكل سلالة لون مستقرة. تحتوي البويضات البرية على 6 أجسام DAPI في المتوسط ، و 5 أزواج أوتوسوم ، وزوج كروموسوم الجنس. وجود 12 هيئة DAPI في البويضات من سلالات لون مستقرة يشير إلى أن الحيوانات في هذه السلالة هي إما جزئية (4 مجموعات من Autosomes، 3 X-الكروموسومات) أو كاملة (4 مجموعات من Autosomes، 4 X-الكروموسومات) tetraploids.
- احسب متوسط عدد أجسام DAPI التي لوحظت من عدة (10 على الأقل) البويضات لكل سلالة. بعض أزواج الكروموسومات سوف تكون مؤثرة أو مباشرة فوق بعضها البعض ، لذلك فإن عدد أجسام DAPI في البويضات غالبا ما يكون أصغر من العدد الفعلي لأزواج الكروموسومات.
- (اختياري) مزيد من التحقق من صحة سلالات لون مستقرة حيث متوسط عدد الهيئات DAPI هو 12 لاختبار ما إذا كانت كاملة (4A، 4X) أو جزئية (4A، 3X) tetraploids عن طريق تلطيخ immunofluorescence ضد بروتينات محور الكروموسوم مثل HTP-3. هذا التلطيخ سيميز أزواج الكروموسومات من خلال إظهار نمط صليبي من كروموسومات واحدة غير متصلة موجودة في رباعي الأرجل الجزئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 |
