Fixation de l’éthanol et coloration DAPI : une méthode pour visualiser l’ADN chez C. elegans

Overview

Ici, nous décrivons une technique utilisée pour visualiser l’ADN génomique dans des nématodes fixes et intacts. La vidéo comprend un protocole d’exemple pour compter la chromatine dans les ovocytes C. elegans non fécondés.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Clarke et coll., Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Les souches tétraploïdes peuvent être validées en comptant le nombre de chromosomes dans leurs ovocytes non fécondés. La microscopie fluorescente peut être utilisée pour dépister le nombre de paires chromosomiques dans les ovocytes diploïdes non fécondés (avant les divisions méiotiques), si la souche a un marqueur fluorescent pour les chromosomes. En l’absence de marqueurs chromosomiques fluorescents, les nématodes tétraploïdes peuvent être examinés en fixant les nématodes et en souinant avec un colorant d’ADN; voir ci-dessous pour un protocole pour la fixation de l’éthanol et de l’animal entier 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) coloration.

Coloration entière de DAPI d’animal

REMARQUE: Les souches tétraploïdes transportant 12 paires chromosomiques connectées peuvent être validées par la coloration dapi de ces animaux et le comptage du nombre de corps DAPI dans ses ovocytes non fécondés.

1. Placez 5 à 10 μL de tampon M9 sur une lame de microscope, puis transférez 6 à 10 nématodes à la goutte.
2. Sous un microscope disséquant, tirez la majeure partie du M9 de la goutte sans enlever les nématodes avec un tissu nettoyant sans peluche. Ensuite, ajoutez immédiatement une goutte de 10 μL de 90% d’éthanol sur les vers. Laissez sécher complètement les vers, mais pas plus de quelques secondes.
3. Dès que l’éthanol s’évapore (cela peut être vu comme il arrive sous le microscope disséquant), ajouter 10 μL supplémentaires de 90% d’éthanol sur les vers.
4. Répétez l’étape 3.1.3 trois fois de plus.
5. Une fois que la dernière goutte d’éthanol s’est évaporée, ajouter 6 μL de colorant DAPI ou Hoechst à la concentration finale recommandée dans le support de montage de choix (par exemple, une dilution de 1/1 000 d’une concentration de 2 ng/μL de stocks de DAPI dans M9). Pour le stockage à long terme des glissières, 0,5% p-phénylènediamine dissous en 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, en glycérol à 90% comme solution d’antifade, au lieu de M9 seulement, peuvent être utilisés.
6. Couvrir les vers sur la lame avec un coverslip et sceller les bords du coverslip avec du vernis à ongles. Score au microscope à fluorescence (étape 3.1.7) au moins 10 min après l’ajout du coverslip. Les diapositives sans antifade peuvent être stockées pendant quelques jours à 4 °C avant de marquer, mais la qualité de la fluorescence commence à diminuer après quelques jours.
7. À l’aide d’un microscope fluorescent à 100 X grossissement, marquer le nombre de corps DAPI unique (probablement des paires chromosomiques simples) dans l’ovocyte non fécondé le plus mature, qui est immédiatement adjacent au spermatheca et n’est pas encore entré dans le spermatheca ou l’utérus.
   1. Pour marquer les corps individuels de DAPI dans un noyau d’ovocyte, utilisez la mise au point fine du microscope pour se déplacer lentement du haut du noyau d’ovocyte au fond pendant le comptage. Ensuite, racontez le même noyau tout en déplaçant la mise au point dans la direction opposée(c.-à-d.du bas vers le haut du noyau) pour confirmer le nombre compté de corps DAPI.
8. Marquer l’ovocyte non fécondé le plus mature dans chacune des deux oisons dans au moins dix hermaphrodites par souche stable de Lon. Les ovocytes de type sauvage ont 6 corps DAPI en moyenne, 5 paires autosome, et la paire de chromosomes sexuels. La présence de 12 corps DAPI dans l’ovocyte de souches stables de Lon indique que les animaux de cette souche sont soit partiels (4 ensembles d’Autosomes, 3 chromosomes X) soit complets (4 ensembles d’Autosomes, 4 chromosomes X) tétraploïdes.
9. Calculer le nombre moyen de corps DAPI observés à partir de plusieurs (au moins 10) ovocytes par souche. Certaines paires chromosomiques se touchent ou se touchent les unes sur les autres, de sorte que le nombre de corps DAPI dans un ovocyte est souvent plus petit que le nombre réel de paires chromosomiques.
10. (Facultatif) Valider davantage les souches stables de Lon où le nombre moyen de corps DAPI est de 12 pour tester si elles sont pleines (4A, 4X) ou partielles (4A, 3X) tétraploïdes par immunofluorescence tacher contre les protéines de l’axe chromosomique telles que HTP-3. Cette coloration distinguera les paires chromosomiques en montrant un modèle cruciforme à partir de chromosomes simples non reliés présents dans le tétraploïde partiel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025