Overview
כאן, אנו מתארים טכניקה המשמשת להמחזת דנ"א גנומי בנמטודות קבועות שלמות. הסרטון כולל פרוטוקול לדוגמה לספירת כרומטין ביציות C. elegans לא מופרות.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך קלארק ואח ', מניפולציה של Ploidy ב Caenorhabditis אלגנס, J. Vis. Exp. (2018).
זני Tetraploid ניתן לאמת על ידי ספירת מספר הכרומוזומים ביציות שלהם לא מופרית. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכולה לשמש לסינון מספר זוגות הכרומוזום ביציות דיפלואידיות לא מופרות (לפני החלוקה הביוטית), אם לזן יש סמן פלואורסצנטי לכרומוזומים. בהיעדר סמני כרומוזום פלואורסצנטיים, ניתן לסנן נמטודות טטראפלואידיות על ידי תיקון הנמטודות והכתמת צבע DNA; ראה להלן פרוטוקול לתיקון אתנול וחיה שלמה 4′,6-דיאמידין-2′-פנילינדול דיהידרוכלוריד (DAPI) מכתים.
כתמי DAPI של בעלי חיים שלמים
שים לב: זני Tetraploid הנושאים 12 זוגות כרומוזום מחובר יכול להיות מאומת על ידי DAPI מכתים בעלי חיים אלה וסופרים את מספר גופי DAPI ביציות הלא מופרות שלה.
- מניחים 5 עד 10 μL של מאגר M9 על שקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן להעביר 6 - 10 nematodes לירידה.
- תחת מיקרוסקופ מנתח, לצייר את רוב M9 מן הירידה מבלי להסיר את nematodes עם רקמת ניקוי ללא מוך. לאחר מכן, מיד להוסיף טיפה 10 μL של 90% אתנול על התולעים. אפשר לתולעים להתייבש לחלוטין, אבל לא יותר מכמה שניות.
- ברגע אתנול מתאדה (זה יכול להיראות כפי שהוא קורה תחת מיקרוסקופ לנתח), להוסיף 10 μL נוספים של 90% אתנול על התולעים.
- חזור על שלב 3.1.3 שלוש פעמים נוספות.
- לאחר הטיפה האחרונה של אתנול התאדה, להוסיף 6 μL של DAPI או צבע Hoechst בריכוז הסופי המומלץ במדיה הרכבה של בחירה (לדוגמה, דילול 1:1,000 של 2 ng / μL DAPI ריכוז מלאי M9). עבור אחסון לטווח ארוך של השקופיות, 0.5% p-פנילנדיאמין מומס ב 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, ב 90% גליצרול כפתרון נגד פשיד, במקום M9 בלבד, ניתן להשתמש.
- מכסים את התולעים בשקופית עם כיסוי ולאטום את הקצוות של coverlip עם לק. ציון במיקרוסקופ פלואורסצנטי (שלב 3.1.7) לפחות 10 דקות לאחר הוספת הכיסוי. שקופיות ללא antifade ניתן לאחסן במשך כמה ימים ב 4 מעלות צלזיוס לפני הניקוד, אבל איכות הפלואורסצנטיות מתחיל לרדת לאחר כמה ימים.
- באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה פי 100, ניקוד מספר גופים DAPI יחיד (ככל הנראה זוגות כרומוזום יחיד) בביצית לא מופרית הבוגרת ביותר, אשר מיד סמוך spermatheca ועדיין לא נכנס הזרעון או הרחם.
- כדי להבקיע גופי DAPI בודדים בתוך גרעין ביצית, השתמש במיקוד העדין של המיקרוסקופ כדי לנוע לאט מהחלק העליון של גרעין ביצית לתחתית במהלך הספירה. לאחר מכן, ספירה חוזרת של אותו גרעין תוך הזזת המוקד בכיוון ההפוך (כלומר,מלמטה לחלק העליון של הגרעין) כדי לאשר את המספר שנספר של גופי DAPI.
- ציון ביצית לא מופרית הבוגרת ביותר בכל אחד משני gonads לפחות עשרה הרמפרודיטים לכל זן לון יציב. ביציות מסוג בר כוללות 6 גופי DAPI בממוצע, 5 זוגות אוטוזום וזוג כרומוזום המין. נוכחותם של 12 גופי DAPI ביצית של זני לון יציבים מצביעה על כך שבעלי החיים בזן זה הם חלקיים (4 סטים של אוטוזומים, 3 כרומוזומי X) או משלימים (4 סטים של אוטוזומים, 4 כרומוזומי X) טטראפלואידים.
- חשב את המספר הממוצע של גופי DAPI שנצפו מכפולות (לפחות 10) ביציות לכל זן. כמה זוגות כרומוזום יהיה נוגע או ממש על גבי אחד את השני, כך מספר גופי DAPI ביצית הוא לעתים קרובות קטן יותר מאשר המספר האמיתי של זוגות כרומוזום.
- (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' עוד יותר לאמת זנים Lon יציב שבו המספר הממוצע של גופי DAPI הוא 12 כדי לבדוק אם הם מלאים (4A, 4X) או חלקי (4A, 3X) tetraploids על ידי חיסון הכתמת נגד חלבוני ציר כרומוזום כגון HTP-3. כתמים אלה יבחינו זוגות כרומוזום על ידי הצגת דפוס צלב מ כרומוזומים בודדים שאינם מחוברים נוכח tetraploid חלקית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 |
