Overview
여기서는 고정된 선충에서 유전체 DNA를 시각화하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 비디오에는 수정되지 않은 C. elegans 난모세포에서 크로마틴을 계산하는 예제 프로토콜이 포함되어 있습니다.
Protocol
이 프로토콜은 클라크 외에서발췌, Caenorhabditis elegans에서플로이디의 조작, J. Vis. Exp. (2018).
테트라플로이드 균주는 수정되지 않은 난모세포에서 염색체 수를 계산하여 검증될 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 균주가 염색체에 대한 형광 마커가있는 경우 (메이오틱 분열 이전)에서 염색체 쌍의 수를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 염색체 마커가 없는 경우, 테트라클로드 선충은 선충을 고정하고 DNA 염료로 염색함으로써 스크리닝될 수 있다. 에탄올 고정 및 전체 동물 4′,6-디아미딘-2′-페닐린돌 디하이드로클로리드(DAPI) 염색에 대한 프로토콜은 아래를 참조하십시오.
전체 동물 DAPI 염색
참고: 12개의 연결된 염색체 쌍을 운반하는 Tetraploid 균주는 DAPI가 이 동물을 염색하고 수정되지 않은 난소귀에 있는 DAPI 바디의 수를 계산하여 검증될 수 있습니다.
- 현미경 슬라이드에 M9 버퍼의 5 ~ 10 μL을 배치 한 다음 6 - 10 선충을 드롭으로 옮기십시오.
- 해부 현미경에서, 보풀이없는 청소 조직선충을 제거하지 않고 드롭에서 M9의 대부분을 그립니다. 그런 다음 즉시 웜에 90 % 에탄올의 10 μL 방울을 추가합니다. 벌레가 완전히 건조할 수 있지만 몇 초 이상 건조할 수 있습니다.
- 에탄올이 증발하자마자(해부 현미경하에서 발생하는 것으로 볼 수 있음), 웜에 90% 에탄올의 10μL을 추가로 추가합니다.
- 3.1.3 단계를 세 번 더 반복합니다.
- 에탄올의 마지막 방울이 증발되면, 선택의 마운팅 매체에서 권장되는 최종 농도에 DAPI 또는 Hoechst 염료6 μL을 추가하십시오(예: M9의 2 ng/μL DAPI 재고 농도의 1:1,000 희석). 슬라이드의 장기 보관을 위해, 0.5% p-phenylenediamine 20 mM Tris-HCl에 용해, pH 8.8, 90% 글리세롤항페이드 용액으로, M9만이 아닌, 사용될 수 있다.
- 슬라이드의 웜을 커버슬립으로 덮고 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 형광 현미경 (단계 3.1.7) 커버 슬립을 추가 한 후 적어도 10 분 에서 점수. 안티 페이드없이 슬라이드는 채점하기 전에 4 °C에서 며칠 동안 저장할 수 있지만 형광의 품질은 며칠 후에 떨어지기 시작합니다.
- 100X 배율에서 형광 현미경을 사용하여, 가장 성숙한 불균성 난소에서 단일 DAPI 바디 (아마도 단 하나 염색체 쌍)의 수를 점수, 이는 즉시 정자에 인접하고 아직 정자 또는 자궁을 입력하지 않은.
- oocyte 핵 내에서 개별 DAPI 바디를 채점하려면 현미경의 미세 한 초점을 사용하여 계산하는 동안 난낭 핵의 상단에서 바닥으로 천천히 이동합니다. 이어서, DAPI 바디의 카운트 수를 확인하기 위해반대 방향으로 초점을 이동하면서 동일한 핵을 재검표한다(즉, 핵의 아래쪽에서 상부까지).
- 안정된 론 균주 당 적어도 10 헤르마로디트에서 두 개의 조나 각각에서 가장 성숙한 수정되지 않은 난모세포 점수를 매깁니다. 야생 형 난모세포는 평균 6 DAPI 바디, 5 자동 쌍 및 성 염색체 쌍을 가지고 있습니다. 안정된 론 균주의 난마귀에 12DAPI 바디의 존재는 이 긴장에 있는 동물이 부분(자동4세트, 3개의 X 염색체) 또는 완전(자동4세트, 4개의 X 염색체) 테트라클로이드임을 나타낸다.
- 변형당 여러(최소 10개) 난모세포에서 관찰되는 DAPI 바디의 평균 수를 계산합니다. 일부 염색체 쌍은 서로 접촉하거나 바로 위에 닿기 때문에 난모체에 있는 DAPI 바디의 수는 종종 염색체 쌍의 실제 수보다 작습니다.
- (선택 사항) 또한 DAPI 바디의 평균 수가 12인 안정된 론 균주를 추가로 검증하여 HTP-3과 같은 염색체에 대한 면역형광 염색에 의해 전체(4A, 4X) 또는 부분(4A, 3X) 테트라클로이드인지 여부를 테스트한다. 이 염색은 부분 테트라클로드에 존재하는 단일 연결되지 않은 염색체로부터 십자형 패턴을 보여줌으로써 염색체 쌍을 구별합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 |
