Overview
Aqui, descrevemos uma técnica usada para visualizar DNA genômico em nematoides fixos e intactos. O vídeo inclui um protocolo de exemplo para contar cromatina em oócitos C. elegans não fertilizados.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Clarke et al, Manipulação de Ploidy em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
As cepas tetraploides podem ser validadas contando o número de cromossomos em seus oócitos não fertilizados. A microscopia fluorescente pode ser usada para testar o número de pares de cromossomos em oócitos diploides não fertilizados (antes das divisões meioticas), se a cepa tiver um marcador fluorescente para cromossomos. Na ausência de marcadores de cromossomo fluorescente, os nematoides tetraploides podem ser rastreados fixando os nematoides e manchando com um corante de DNA; veja abaixo um protocolo para fixação de etanol e coloração de 4′,6-Diamidina-2′-fenildlorida (DAPI).
Coloração de DAPI animal inteiro
NOTA: Cepas tetraploides que carregam 12 pares de cromossomos conectados podem ser validadas pela dapi manchando esses animais e contando o número de corpos DAPI em seus oócitos não fertilizados.
- Coloque de 5 a 10 μL de tampão M9 em um slide de microscópio e, em seguida, transfira 6 - 10 nematoides para a queda.
- Sob um microscópio dissecando, retire a maior parte do M9 da gota sem remover os nematoides com um tecido de limpeza sem fiapos. Em seguida, adicione imediatamente uma queda de 10 μL de 90% de etanol nos vermes. Deixe os vermes secarem completamente, mas por não mais do que alguns segundos.
- Assim que o etanol evaporar (isso pode ser visto como acontece sob o microscópio de dissecação), adicione um adicional de 10 μL de 90% de etanol sobre os vermes.
- Repita o passo 3.1.3 mais três vezes.
- Uma vez que a última gota de etanol tenha evaporado, adicione 6 μL de corante DAPI ou Hoechst na concentração final recomendada na mídia de montagem de escolha (por exemplo, uma diluição de 1:1.000 de uma concentração de estoque DAPI de 2 ng/μL em M9). Para o armazenamento a longo prazo dos slides, 0,5% p-fenilediamina dissolvida em 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, em 90% glicerol como solução antifato, em vez de apenas M9, pode ser usado.
- Cubra os vermes no slide com uma mancha de cobertura e sele as bordas da tampa com esmalte. Pontuação em um microscópio de fluorescência (passo 3.1.7) pelo menos 10 minutos após a adição do deslizamento de tampas. Slides sem antifado podem ser armazenados por alguns dias a 4 °C antes de marcar, mas a qualidade da fluorescência começa a diminuir após alguns dias.
- Usando um microscópio fluorescente na ampliação de 100X, escorra o número de corpos daPI únicos (presumivelmente pares de cromossomo único) no oócito não fertilizado mais maduro, que é imediatamente adjacente à espermatozoide e ainda não entrou na espermatozoide ou no útero.
- Para marcar corpos daPI individuais dentro de um núcleo oócito, use o foco fino do microscópio para mover-se lentamente do topo do núcleo oócito para o fundo durante a contagem. Em seguida, reconta o mesmo núcleo enquanto move o foco na direção oposta (ou seja,da parte inferior até a parte superior do núcleo) para confirmar o número contado de corpos DAPI.
- Marque o oócito não fertilizado mais maduro em cada uma das duas gônadas em pelo menos dez hermafroditas por cepa lon estável. Os oócitos do tipo selvagem têm 6 corpos DAPI em média, 5 pares de autossómos e o par de cromossomos sexuais. A presença de 12 corpos DAPI no oócito de cepas estáveis de Lon indica que os animais nesta cepa são parciais (4 conjuntos de Autosomes, 3 cromossomos X) ou completos (4 conjuntos de autossomos, 4 cromossomos X).
- Calcule o número médio de corpos DAPI observados a partir de vários (pelo menos 10) oócitos por cepa. Alguns pares de cromossomos estarão se tocando ou bem em cima um do outro, de modo que o número de corpos DAPI em um oócito é muitas vezes menor do que o número real de pares de cromossomos.
- (Opcional) Valide ainda mais as cepas estáveis de Lon onde o número médio de corpos DAPI é de 12 para testar se eles estão cheios (4A, 4X) ou tetraploides parciais (4A, 3X) por manchas de imunofluorescência contra proteínas do eixo cromossomo, como HTP-3. Esta coloração distinguirá os pares de cromossomos mostrando um padrão cruciforme de cromossomos não ligados únicos presentes no tetraploide parcial.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 |