Ensayo de parálisis inducida por natación (SWIP): Un método para cuantificar la locomoción mediada por dopamina en C. elegans

Overview

Aquí, presentamos un ensayo para medir swip, un fenotipo conductual de C. elegans que ocurre durante el movimiento vigoroso como la natación.  El protocolo de ejemplo describe enfoques de análisis manuales y automatizados.

Protocol

El siguiente protocolo es un extracto de Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP

NOTA: Describimos el método manual de evaluación de SWIP en gusanos de tipo salvaje tratados con AMPH. También discutimos brevemente el seguimiento de gusanos y el análisis posterior de la cinética de gusanos utilizando un rastreador de gusanos automatizado y un software de seguimiento que fueron descritos previamente por Hardaway et al.

1. Método manual para probar para SWIP
   1. Aliquot 40 μL de solución de sacarosa de 200 mOsm/L con o sin 0,5 mM AMPH en una placa de punto de vidrio. Bajo el estereoscopio, elige gusanos de etapa 8-10 de L4 tardía con una pestaña o una selección de platino y sumerge la selección en la placa que contiene la solución hasta que los gusanos se muevan de la selección y naden en la solución. Tenga en cuenta el número de gusanos recogidos en el pozo, inicie el temporizador, observe y registre el número de gusanos que exhiben SWIP en cada marca de minutos.
   2. Copie los datos sin procesar en una hoja de cálculo y calcule el porcentaje de gusanos paralizados dividiendo el número de gusanos paralizados en cada minuto por el número total de gusanos probados a lo largo del ensayo y multiplique por 100. Copie los valores de porcentaje en cualquier software de gráficos y estadísticos y trace los datos con valores porcentuales en el eje Y y el tiempo en el eje X utilizando el formato de gráfico XY.
   3. Realizar ANOVA bidireccional seguido de análisis post hoc (por ejemplo, Bonferroni post-prueba) para probar la importancia estadística entre el control, los grupos AMPH y el tiempo de tratamiento.
2. Análisis automatizado de SWIP
   1. Realice análisis automatizados en un solo gusano a la vez. El protocolo para configurar la cámara, el software de seguimiento de gusanos y el script para ejecutar el análisis de software de seguimiento se describen en detalle en Hardaway et al.
   2. Brevemente, coloque un solo hermafrodita de etapa L4 tardío en una placa de punto de vidrio utilizando una selección de pestañas, como se describe en el método manual en la sección 1.1.2. Grabe vídeos de natación de un gusano en ese momento y utilice el software de seguimiento de gusanos para calcular la frecuencia de las curvas del cuerpo.
   3. Siga el script proporcionado con el software de seguimiento para obtener la frecuencia de thrashing gusano y generar mapas de calor a partir de los datos de thrashing gusano.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/