Schwimmen-induzierte Lähmung (SWIP) Assay: Eine Methode zur Quantifizierung von Dopamin-vermittelter Fortbewegung bei C. elegans

Overview

Hier führen wir einen Test ein, um SWIP zu messen, einen verhaltensähnlichen Phänotyp von C. elegans, der während einer kräftigen Bewegung wie Schwimmen auftritt.  Das Beispielprotokoll behandelt sowohl manuelle als auch automatisierte Analyseansätze.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamin Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP

HINWEIS: Wir beschreiben die manuelle Methode zur Bewertung von SWIP bei Wildwürmern, die mit AMPH behandelt werden. Wir besprechen auch kurz die Verfolgung von Würmern und die weitere Analyse der Wurmkinetik mit einem automatisierten Wurm-Tracker und einer Tracking-Software, die zuvor von Hardaway et al. beschrieben wurden.

1. Manuelle Methode zum Testen auf SWIP
   1. Aliquot 40 l von 200 mOsm/L Saccharoselösung entweder mit oder ohne 0,5 mM AMPH in eine Glas-Spotplatte. Unter dem Stereoskop 8-10 Spätl4-Bühnenwürmer mit einer Wimpern- oder Platin-Pick-Hose pflücken und die Pick in die Platte eintauchen, die die Lösung enthält, bis Würmer sich von der Kommission entfernen und in die Lösung schwimmen. Beachten Sie die Anzahl der Würmer, die in den Brunnen gepflückt wurden, starten Sie den Timer, beobachten sie und notieren Sie die Anzahl der Würmer, die SWIP bei jeder Minutenmarke ausstellen.
   2. Kopieren Sie die Rohdaten in eine Kalkulationstabelle und berechnen Sie den Prozentsatz der gelähmten Würmer, indem Sie die Anzahl der Würmer, die in jeder Minute gelähmt sind, durch die Gesamtzahl der Würmer dividieren, die während des Tests getestet wurden, und multiplizieren Sie sie mit 100. Kopieren Sie die Prozentwerte in jede Grafik- und Statistiksoftware, und zeichnen Sie die Daten mit Prozentwerten auf der Y-Achse und zeit auf der X-Achse im XY-Diagrammformat.
   3. Führen Sie eine zweiseitige ANOVA durch, gefolgt von einer Post-hoc-Analyse (z. B. Bonferroni-Post-Test), um die statistische Signifikanz zwischen Kontrolle, AMPH-Gruppen und Behandlungszeitpunkt zu testen.
2. Automatisierte Analyse von SWIP
   1. Führen Sie eine automatisierte Analyse für einen einzelnen Wurm gleichzeitig durch. Das Protokoll zum Einrichten der Kamera, der Wurm-Tracker-Software und des Skripts zum Ausführen der Tracking-Softwareanalyse werden in Hardaway et al.ausführlich beschrieben.
   2. Legen Sie kurz ein einzelnes spätes L4-Stadium Hermaphrodit in eine Glasfleckplatte unter Verwendung einer Wimpernpickung, wie in der manuellen Methode in Abschnitt 1.1.2 beschrieben. Nehmen Sie Schwimmvideos eines Wurms auf und verwenden Sie die Wurm-Tracker-Software, um die Häufigkeit von Körperbiegungen zu berechnen.
   3. Folgen Sie dem Skript, das mit der Tracking-Software zur Verfügung gestellt wird, um wurmige Thrashing-Frequenz zu erhalten und Wärmekarten aus den Wurm-Thrashing-Daten zu generieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/