Svømning-induceret lammelse (SWIP) Assay: En metode til at kvantificere dopamin-medieret bevægelse i C. elegans

Overview

Her introducerer vi en analyse for at måle SWIP, en adfærdsmæssig fænotype af C. elegans, der opstår under kraftig bevægelse som svømning.  Eksempelprotokollen diskuterer både manuelle og automatiserede analysemetoder.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Kudumala et al. Svømning induceret lammelse for at vurdere dopaminsignalering i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP

BEMÆRK: Vi beskriver den manuelle metode til vurdering af SWIP i orme af vild type behandlet med AMPH. Vi diskuterer også kort sporing af orme og yderligere analyse af ormkinetik ved hjælp af en automatiseret orm tracker og en sporingssoftware, som tidligere blev beskrevet af Hardaway et al.

1. Manuel metode til test for SWIP
   1. Aliquot 40 μL af 200 mOsm/L saccharoseopløsning enten med eller uden 0,5 mM AMPH i en glaspletplade. Under stereoskopet skal du vælge 8-10 sene L4-sceneorme med en øjenvippe eller platinplukke og nedsænke plukket i pladen, der indeholder opløsningen, indtil ormene bevæger sig væk fra plukket og svømmer ind i opløsningen. Bemærk antallet af orme plukket i brønden, starte timeren, observere og registrere antallet af orme udstiller SWIP på hvert minut mærke.
   2. Kopier de rå data til et regneark, og beregn procentdelen af orme, der er lammet, ved at dividere antallet af orme, der er lammet hvert minut, med det samlede antal orme, der er testet i hele analysen, og gang med 100. Kopier procentværdierne til grafer og statistisk software, og afknyt dataene med procentværdier på Y-aksen og tid på X-aksen ved hjælp af XY-grafformatet.
   3. Udfør tovejs ANOVA efterfulgt af post-hoc-analyse (f.eks. Bonferroni efter testen) for at teste for statistisk signifikans blandt kontrol, AMPH-grupper og behandlingstid.
2. Automatiseret analyse af SWIP
   1. Udfør automatiseret analyse på en enkelt orm ad gangen. Protokollen til opsætning af kamera, ormen tracker software og script til at køre tracking software analyse er beskrevet i detaljer i Hardaway et al.
   2. Kort, placere en enkelt sen L4 fase hermafrodit i et glas spot plade udnytte en øjenvipper pick, som beskrevet i den manuelle metode i punkt 1.1.2. Optag svømning videoer af en orm på det tidspunkt og bruge ormen tracker software til at beregne hyppigheden af kroppen bøjninger.
   3. Følg scriptet forsynet med tracking software til at opnå orm prygl frekvens og til at generere varme kort fra ormen prygl data.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/