Analyse de paralysie induite par la natation (SWIP) : Une méthode pour quantifier la locomotion dopaminerique dans C. elegans

Overview

Ici, nous introduisons un essai pour mesurer SWIP, un phénotype comportemental de C. elegans qui se produit pendant le mouvement vigoureux comme la natation.  Le protocole d’exemple traite à la fois des approches d’analyse manuelle et automatisée.

Protocol

Le protocole suivant est un extrait de Kudumala et coll., Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP (SWIP)

REMARQUE: Nous décrivons la méthode manuelle d’évaluation du SWIP chez les vers de type sauvage traités par AMPH. Nous discutons également brièvement du suivi des vers et de l’analyse plus poussée de la cinétique des vers à l’aide d’un traqueur automatisé de vers et d’un logiciel de suivi qui ont déjà été décrits par Hardaway et coll.

1. Méthode manuelle à tester pour swip
   1. Aliquot 40 μL de solution saccharose de 200 mOsm/L avec ou sans AMPH de 0,5 mM dans une plaque de verre. Sous le stéréoscope, choisissez des vers de stade 8-10 à un stade L4 tardif avec un cil ou un pic de platine et submergez la pioche dans la plaque contenant la solution jusqu’à ce que les vers se déplacent hors de la pioche et nagent dans la solution. Notez le nombre de vers ramassés dans le puits, démarrez la minuterie, observez et enregistrez le nombre de vers présentant swip à chaque marque minute.
   2. Copiez les données brutes dans une feuille de calcul et calculez le pourcentage de vers paralysés en divisant le nombre de vers paralysés à chaque minute par le nombre total de vers testés tout au long de l’analyse et multipliez par 100. Copiez les valeurs en pourcentage dans n’importe quel logiciel graphique et statistique et tracez les données avec des valeurs en pourcentage sur l’axe Y et le temps sur l’axe X en utilisant le format graphique XY.
   3. Effectuer anova dans les deux sens suivi d’une analyse post-hoc (p. ex., Bonferroni après le test) pour vérifier la signification statistique chez les témoins, les groupes amph et le temps de traitement.
2. Analyse automatisée du SWIP
   1. Effectuez une analyse automatisée sur un seul ver à la fois. Le protocole pour configurer la caméra, le logiciel de suivi des vers et le script pour exécuter l’analyse logicielle de suivi sont décrits en détail dans Hardaway et al.
   2. En bref, placez une seule hermaphrodite tardive de l’étape L4 dans une plaque de verre à l’aide d’un pic à cils, tel que décrit dans la méthode manuelle de la section 1.1.2. Enregistrez des vidéos de natation d’un ver à l’époque et utilisez le logiciel de suivi des vers pour calculer la fréquence des plis du corps.
   3. Suivez le script fourni avec le logiciel de suivi pour obtenir la fréquence de thrashing de ver et pour générer des cartes de chaleur à partir des données de thrashing de ver.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/