Overview
ここでは、泳ぐような激しい運動の間に起こるC.エレガンスの行動表現型であるSWIPを測定するためのアッセイを紹介する。 このプロトコル例では、手動分析アプローチと自動分析アプローチの両方について説明します。
Protocol
以下のプロトコルは、カエノハブディティス・エレガンス、J.Vis.Exp.(2019年)におけるドーパミンシグナル伝達を評価するためのクドゥマラら、水泳誘発麻痺からの抜粋である。
スウィップ
注:AMPHで処理した野生型ワームのSWIPを手動で評価する方法について説明する。また、自動化されたワームトラッカーと以前Hardawayらによって記述された追跡ソフトウェアを使用したワームの追跡とワーム動態のさらなる分析についても簡単に説明 します。
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SWIP をテストする手動方式
- アリコート 40 μL 200 mOsm/L スクロース溶液は、ガラススポットプレートに0.5 mM AMPHの有無にかかわらず。ステレオスコープの下で、まつげまたはプラチナピックで8-10 late-L4ステージワームを選び、ワームがピックから離れて溶液に泳ぐまで、溶液を含むプレートにピックを沈めます。井戸に取り込まれたワームの数に注意し、タイマーを開始し、毎分マークでSWIPを示すワームの数を観察し、記録します。
- 生データをスプレッドシートにコピーし、1分間に麻痺したワームの数をアッセイ全体でテストされたワームの総数で割り、100を掛けることで麻痺したワームの割合を計算します。パーセント値を任意のグラフおよび統計ソフトウェアにコピーし、XY グラフ形式を使用して、Y 軸にパーセント値を、X 軸に時間をプロットします。
- 双方向ANOVAを実行し、続いてポストホック分析(例えば、ボンフェローニ後検定)を行い、対照、AMPHグループおよび治療時間の間で統計的有意性を検定する。
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SWIPの自動分析
- 一度に 1 つのワームに対して自動分析を実行します。カメラをセットアップするプロトコル、トラッキングソフトウェア分析を実行するワームトラッカーソフトウェアとスクリプトは、Hardaway らで詳細に説明されています。
- 簡単に言えば、セクション1.1.2の手動方法で説明されているように、単一の後期L4ステージの雌雄同体を、まつげピックを利用したガラススポットプレートに入れます。当時の1つのワームの水泳ビデオを記録し、ワームトラッカーソフトウェアを使用してボディベンドの頻度を計算します。
- 追跡ソフトウェアに付属のスクリプトに従って、ワームスラッシング頻度を取得し、ワームスラッシングデータからヒートマップを生成します。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
Eye lash | |||
Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |