Ensaio de paralisia induzida por natação (SWIP): Um método para quantificar a locomoção mediada por dopamina em C. elegans

Overview

Aqui, introduzimos um ensaio para medir o SWIP, um fenótipo comportamental de C. elegans que ocorre durante movimento vigoroso como a natação.  O protocolo de exemplo discute abordagens de análise manual e automatizada.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP

NOTA: Descrevemos o método manual de avaliação do SWIP em vermes do tipo selvagem tratados com AMPH. Também discutimos brevemente o rastreamento de worms e uma análise mais aprofundada da cinética de worms usando um rastreador automatizado de worms e um software de rastreamento que foram descritos anteriormente por Hardaway et al.

1. Método manual para testar para SWIP
   1. Aliquot 40 μL de 200 mOsm/L solução de sacarose com ou sem 0,5 mM AMPH em uma placa de ponto de vidro. Sob o estereóscópio, escolha 8-10 vermes de estágio L4 tardio com um cílio ou uma picareta de platina e submerse a picareta na placa que contém a solução até que os vermes se movam para fora da picareta e nadem para a solução. Observe o número de worms colhidos no poço, inicie o temporizador, observe e regise o número de worms exibindo SWIP em cada marca de minuto.
   2. Copie os dados brutos em uma planilha e calcule a porcentagem de vermes paralisados dividindo o número de vermes paralisados a cada minuto pelo número total de worms testados ao longo do ensaio e multiplique por 100. Copie os valores por cento em qualquer software gráfico e estatístico e plote os dados com valores porcentos no eixo Y e tempo no eixo X usando o formato gráfico XY.
   3. Realizar a ANOVA bidirecional seguido de análise pós-hoc (por exemplo, bonferroni pós-teste) para testar a significância estatística entre controle, grupos AMPH e tempo de tratamento.
2. Análise automatizada do SWIP
   1. Realize análises automatizadas em um único worm de cada vez. O protocolo para configurar a câmera, o software worm tracker e o script para executar a análise do software de rastreamento são descritos em detalhes em Hardaway et al.
   2. Brevemente, coloque uma única hermafrodita tardia em uma placa de vidro utilizando uma picareta de cílios, conforme descrito no método manual na seção 1.1.2. Grave vídeos de natação de um worm na época e use o software worm tracker para calcular a frequência de dobras corporais.
   3. Siga o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de desbasmento de worms e para gerar mapas de calor a partir dos dados de thrashing de worms.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/