Zwemmen-Geïnduceerde Verlamming (SWIP) Assay: Een methode om dopamine-gemedieerde voortbeweging te kwantificeren in C. elegans

Overview

Hier introduceren we een test om SWIP te meten, een gedragsfenotype van C. elegans dat optreedt tijdens krachtige bewegingen zoals zwemmen.  Het voorbeeldprotocol bespreekt zowel handmatige als geautomatiseerde analysebenaderingen.

Protocol

Het volgende protocol is een fragment uit Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

SWIP

OPMERKING: We beschrijven de handmatige methode voor het beoordelen van SWIP bij wilde wormen behandeld met AMPH. We bespreken ook kort het volgen van wormen en verdere analyse van wormkinetiek met behulp van een geautomatiseerde wormtracker en een trackingsoftware die eerder werden beschreven door Hardaway et al.

1. Handmatige methode om te testen op SWIP
   1. Aliquot 40 μL 200 mOsm/L sacharoseoplossing met of zonder 0,5 mM AMPH in een glazen spotplaat. Pluk onder de stereoscope 8-10 late-L4-fasewormen met een wimper of platinapriem en dompel de plectrum onder in de plaat met de oplossing totdat wormen van de plectrum afgaan en in de oplossing zwemmen. Noteer het aantal wormen dat in de put is geplukt, start de timer, observeer en registreer het aantal wormen dat SWIP vertoont bij elke minuutmarkering.
   2. Kopieer de ruwe gegevens naar een spreadsheet en bereken het percentage verlamde wormen door het aantal wormen dat op elke minuut verlamd is te delen door het totale aantal wormen dat tijdens de test is getest en vermenigvuldig met 100. Kopieer de procentwaarden naar grafieken en statistische software en plot de gegevens met procentuele waarden op de Y-as en tijd op de X-as met behulp van de XY-grafiekindeling.
   3. Voer tweerichtings-ANOVA uit, gevolgd door post-hocanalyse (bijv. Bonferroni post-test) om te testen op statistische significantie tussen controle, AMPH-groepen en het tijdstip van behandeling.
2. Geautomatiseerde analyse van SWIP
   1. Voer geautomatiseerde analyse uit op één worm tegelijk. Het protocol voor het instellen van de camera, de wormtrackersoftware en het script om de analyse van de trackingsoftware uit te voeren, worden in detail beschreven in Hardaway et al.
   2. Plaats kort een enkele late L4-fase hermafrodiet in een glazen spotplaat met behulp van een wimperpriem, zoals beschreven in de handmatige methode in rubriek 1.1.2. Neem zwemvideo's op van één worm op dat moment en gebruik de wormtrackersoftware om de frequentie van lichaamsbochten te berekenen.
   3. Volg het script dat bij de trackingsoftware wordt geleverd om de frequentie van het slaan van wormen te verkrijgen en om heatmaps te genereren op de gegevens van de worm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Eye lash
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/