C. elegans喂养的 RNAI 电镀：一种在大肠杆菌中诱导靶 dsRNA 表达的技术

Overview

此视频描述了 C. elegans RNAi 治疗背后的原则，并演示了在转基因蠕虫菌株中击倒 lin-35 的协议。

Protocol

本协议摘自科伦季奇等人，应用RNAI和热冲击引起的转录因子表达重新编程细菌细胞到神经元在C.elegans，J.Vis.Exp。 (2018). 

1. 解决方案准备
   1. NGM-阿加板 （1 L）
      1. 添加 3 克 NaCl、2.5 克多肽介质（如巴托-佩普顿）和 20 克阿加。自动切割后，加入 1 mL 胆固醇（5 毫克/mL 在 95% EtOH 库存），1 mL 的 1 MgSO_4，1 mL 的 1 MCaCl2， 25 mL 的 1 M K2PO_4，和 1 mL 的安培素 B （2.5 毫克/mL 股票）.
   2. NGM-阿加雷奈板 （1 L）
      1. 添加 3 克 NaCl、2.5 克多肽介质和 20 克阿加。自动切割添加后，1 mL 胆固醇（5 毫克/mL 在 95% EtOH 库存），1 mL 的 1 MgSO_4，1 mL 的 1 MCaCl2， 25 mL 的 1 M K₂PO₄， 1 mL 的安培素 B （2.5 毫克/mL 库存）， 1 mL 的 1 ML 的 1 M IPTG， 和 1 mL 的苯甲酸酯 （50 毫克/mL）.
   3. LB-阿加 （1 L）
      1. 加入10克多酮介质，5克酵母提取物，5克纳克，20克阿加，10毫升1M特里斯pH 8.0。将 H₂O 添加到 1 L。自动切割后，加入 1 mL 的 50 毫克/mL 卡本西林和 2.5 mL 的 5 毫克/mL 四环素。
   4. LB 中等 （1 L）
      1. 加入 10 克 peptone 介质、5 克酵母提取物、5 克 NaCl 和 10 毫升 1 M 特里斯 pH 8.0。将 H₂O 添加到 1 L。高压灭菌后，加入1 mL的50毫克/mL卡苯甲酸素。
   5. M9 缓冲区 （1 L）
      1. 加入 6.0 克纳₂HPO₄， 3 克 KH₂PO₄， 5 克纳克， 和 50 毫克明胶.使用前，添加 1 mL 的 1 MGSO₄。
   6. 漂白溶液（10mL）
      1. 添加1毫升的纳克洛和2毫升的5 N纳霍。将H2O添加到10升。
2. 准备 RNAI 板
   注： C. elegans 通常在实验室中培养在 6 厘米的培养板上，其中含有 7.5 mL 的线虫生长中等 Agar （NGM-Agar）。此协议针对保持在 15 °C 的蠕虫进行了优化。 要用NGM制备板，请使用标准的无菌技术防止真菌和细菌污染。以下是为 RNAi 准备 NGM 板并辅以试剂的协议。
   1. 准备 6 厘米 NGM-Agar RNAi 板，内含 1 mM 伊索罗皮尔β-D-1-硫基拉托皮拉诺赛德 （IPTG） 和 50μg/mL 苯丙胺。在黑暗的12度室温下，让它们干燥24-48小时。
      1. 将 RNAi 板保持在 4 °C 的黑暗中。如果年龄超过 14 天，请不使用。
   2. 选择含有L4440质粒的RNAi细菌（大肠杆菌HT115）克隆，使用三相条纹模式，从LB-agar板上可用的RNAi库中用林-53基因DNA序列中的林-53基因DNA序列，其中含有50微克/毫升苯甲酸酯和12.5微克/mL四环素。在37°C的夜间生长细菌。这种克隆允许在细菌中依赖IPTG生产林-53 dsRNA。
      1. 此外，种植含有L4440质粒的RNAi细菌，而没有任何基因序列作为空向量控制。
   3. 第二天，使用 200 μL 移液器尖端从lin-53或空矢量 LB-agar 板中挑选一个菌落，并将每个菌落接种到包含 2 mL 液体 LB 介质的单独培养管中，并辅以 50μg/mL 苯甲酸酯。在 37 °C 的夜间培养，直到它们达到 600 nm 的 0.6 - 0.8 的光学密度 （OD）。使用光谱仪测量OD。
      注意：液体LB介质不应含有四环素，与用于从甘油库存中条纹细菌的LB-agar板形成鲜明对比，因为在喂养过程中加入四环素会导致RNAi效率降低。
   4. 使用乘风板将每个细菌培养物（林-53或空载体）的 500 μL 添加到 6 厘米 NGM-Agar RNAi 板中。在室温下在黑暗中用封闭盖子孵化板，以干燥。在此期间，NGM板块中的IPTG会诱导细菌中dsRNA的产生。
      1. 每个实验每个细菌培养至少使用3个板。这将为每个实验提供 3 个技术复制。
   • 在黑暗中储存干燥的 NGM-agar RNAi 板，其中含有 4 °C 的细菌，最长达两周。
3. C. 埃莱甘斯应变 BAT28 的准备
4. 保持含有转基因otIs305 [hsp-16.2prom： ： che-1， rol-6 （su1006）]和ntIs1 [gcy-5prom：：gfp]OP50 细菌使用标准 NGM-Agar 板在 15 °C.
   注： 有关线虫培养的详细协议，请参阅。rol-6 （su1006）是一种占主导地位的等位基因和常用的表型注射标记^16，导致典型的滚动运动。它被用于otIs305转基因跟踪hsp-16.2prom：：che-1。
   1. 将 BAT28 菌株保持在 15 °C 以随时，以防止hsp-16.2prom 的预先激活：：che-1转基因。尽可能减少暴露在高于 15 °C 的温度下，同时处理应变。
5. 要使蠕虫老化同步，请使用漂白技术。
   1. 使用 900 μL M9 缓冲器洗掉含有成人和 BAT28 鸡蛋的 6 厘米 NGM-Agar 板。在 900 x g 下离心 1 分钟，通过离心蠕虫。去除超自然。
   2. 加入0.5-1 mL的漂白溶液，摇动管子约1分钟，直到成人蠕虫开始爆裂。使用标准立体显微镜进行监视。
   3. 在 900 x g 下离心 1 分钟，通过离心蠕虫。去除超自然。
   4. 通过添加 800 μL 的 M9 缓冲器和 900 x g 的离心工作，将蠕虫颗粒清洗 3 次。
   5. 将清洁过的鸡蛋放在用 OP50 细菌播种的新鲜 NGM 板上。在 15 °C 的 OP50 细菌上生长漂白种群，直到它们达到 L4 阶段（约 4 天）。L4 幼虫可以通过标准立体显微镜在蠕虫的腹腔侧大约一半时被白色斑块识别。
      注： 为了在林-53耗尽时实现生殖细胞到神经元转换表型，它需要在父代（P0）中耗尽。转换表型的评分在下一代（孝顺一代F1）进行。为了达到已经在P0中耗尽的林-53，L4动物受到RNAi。
6. 使用铂线手动将每复制50个L4级蠕虫转移到不包含任何细菌的NGM板上，让蠕虫远离任何转移的OP50细菌。让蠕虫在盘子上移动约5分钟。使用以前用林-53 RNAi细菌（或空向量控制）播种的NGM-Agar RNAi板中的细菌转移到各自的RNAi板块。
   1. 避免将 OP50 细菌转移到实际的 RNAi 板中。快速工作，将应变暴露时间降至高于 15 °C 的温度。
7. 在NGM-Agar RNAi板上孵育蠕虫约7天，直到F1后代的蠕虫达到L3-L4阶段。它们可以明显地与P0动物分离，因为它们比F1后代更大、更厚。
   1. 在标准立体显微镜下目视检查F1后代蠕虫是否显示图1中显示的突出外阴（pvul）表型。RNAi对林-53有双源效应，并导致pvul表型，可用于评估RNAi对林-53是否成功。
      注： RNAi对林-53也可能导致F1胚胎的致命性。如果板在动物到达 L3 – L4 阶段之前暴露在高于 15 °C 的度度下，则此效果会增加。死亡的胚胎可以通过发育和缺乏孵化来识别。
   2. 由于 IPTG 对光敏感，在黑暗中孵化板。

Representative Results

图 1： Rnai 对林 - 53 造成的 Pvul 表型。（上图）L4/年轻成人阶段F1后代蠕虫的DIC图片来自控制或林-53 RNAi治疗的母亲。比例杆 = 20 μm. （底部） 用lin-53 RNAi 处理的动物显示突出的外阴（pvul）表型 （黑色箭头）。pvul表型证实 Rnai 对 lin - 53是成功的。缩放条 = 20μm.请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654