सी एलिगेंस फीडिंग के लिए आरएनएआई चढ़ाना: ई. कोलाई में लक्ष्य dsRNA अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एक तकनीक

Overview

यह वीडियो सी एलिगेंस में आरएनएआई उपचार के पीछे के सिद्धांतों का वर्णन करता है और ट्रांसजेनिक कृमि तनाव में लिन-35 को नॉकआउट करने के लिए एक प्रोटोकॉल को दर्शाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल कोलांडजिक, एट अल,आरएनएआई के अनुप्रयोग और हीट-शॉक-प्रेरित ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एक्सप्रेशन से सी एलिगेंस, जे विस एक्सपीमें न्यूरॉन्स को रोगाणु कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम करने के लिए प्रस्तुत किया गया है। (2018). 

1. समाधान तैयारी
   1. एनजीएम-एगर प्लेट्स (1 एल)
      1. एनएसीएल के 3 ग्राम, पेप्टोन मीडिया के 2.5 ग्राम (जैसे, बैक्टो-पेप्टोन) और 20 ग्राम एगर जोड़ें। ऑटोक्लेविंग के बाद, कोलेस्ट्रॉल की 1 एमएल (95% एटोह स्टॉक में 5 मिलीग्राम/एमएल), 1 एम एमजीएसओ 4 का₁एमएल, 1 एम सीएसीएल2 का 1 एमएल, 1 एम के2पीओ₄का 25 एमएल और एम्फोटेरिन बी (2.5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) का 1 एमएल जोड़ें।
   2. एनजीएम-एगर आरएनएआई प्लेट्स (1 एल)
      1. एनएसीएल के 3 ग्राम, पेप्टोन मीडिया के 2.5 ग्राम और आगर के 20 ग्राम जोड़ें। ऑटोक्लेविंग ऐड के बाद कोलेस्ट्रॉल का 1 एमएल (95% एटोह स्टॉक में 5 मिलीग्राम/एमएल), 1 एम एमजीएसओ के 1 एमएल,₁एम CaCl2 के 1 एमसीएल, 1 एम के₂पीओ_4,एम्फोटेरिसिन बी के 1 एमएल (2.5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक), 1 एम आईपीटीजी के 1 एमएल और 1 एमएल कार्बेनेसिलिन (50 मिलीग्राम/एमएल) की 25 एमएल।
   3. पौंड-एगर (1 एल)
      1. पेप्टोन मीडिया के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 ग्राम, NaCl के 5 ग्राम, आगर के 20 ग्राम, 1 एम Tris पीएच 8.0 के 10 एमएल जोड़ें। एच₂ओ को 1 एल जोड़ें। ऑटोक्लेविंग के बाद इसमें 50 एमजी/एमएल कार्बेनिकिन का 1 एमएल और 5 एमजी/एमएल टेट्रासाइक्लिन का 2.5 एमएल डालें।
   4. पौंड माध्यम (1 एल)
      1. पेप्टोन मीडिया के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 ग्राम, NaCl के 5 ग्राम, और 1 एम Tris पीएच 8.0 के 10 एमएल जोड़ें। एच₂ओ को 1 एल जोड़ें। ऑटोक्लेविंग के बाद इसमें 50 मिलीग्राम/एमएल कार्बेनिकिन का 1 एमएल डालें।
   5. M9-बफर (1 एल)
      1. 6.0 ग्राम_{एनए 2}एचपीओ_4,3 ग्राम केएच₂पीओ_4,5 ग्राम एनएसीएल और 50 मिलीग्राम जिलेटिन जोड़ें। उपयोग से पहले, 1 एम एमजीएसओ 4 का₁मिलियन जोड़ें।
   6. ब्लीचिंग समाधान (10 एमएल)
      1. एनएसीएलओ का 1 एमएल और 5 एन नाओएच का 2 एमएल जोड़ें। 10 एमएल में H2O जोड़ें।
2. आरएनएआई प्लेट्स की तैयारी
   नोट: सी एलिगेंस आमतौर पर 6 सेमी पेट्री प्लेटों पर प्रयोगशाला में सुसंस्कृत होता है जिसमें नेमाटोड ग्रोथ मीडियम एगर (एनजीएम-एगर) का 7.5 एमएल होता है। यह प्रोटोकॉल 15 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए कीड़े के लिए अनुकूलित है। एनजीएम के साथ प्लेटें तैयार करने के लिए, फंगल और बैक्टीरियल संदूषण को रोकने के लिए मानक बाँझ तकनीकों का उपयोग करें। आरएनएआई के लिए रिएजेंट्स के साथ पूरक एनजीएम प्लेटें तैयार करने का प्रोटोकॉल निम्नलिखित है।
   1. 6-सेमी एनजीएम-एगर आरएनएआई प्लेट्स तैयार करें जिसमें 1 एमएम आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगालेक्टोपिरिनोसाइड (आईपीटीजी) और ५० माइक्रोन/एमएल कार्बेबिलिन हैं । उन्हें अंधेरे में कमरे के तापमान पर 24 - 48 घंटे तक सूखने दें.
      1. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर आरएनएआई प्लेट रखें। यदि 14 दिनों से अधिक उम्र का उपयोग न करें।
   2. आरएनएआई बैक्टीरिया(एस्चेरिचिया कोलाई HT115)क्लोन का चयन करें जिसमें उपलब्ध से जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक से लिन-53 जीन डीएनए अनुक्रम के साथ L4440 प्लाज्मिड होता है एलबी-एगर प्लेटों पर आरएनएआई लाइब्रेरी जिसमें ५० माइक्रोग्राम/एमएल कार्बेनिकिन और १२.५ माइक्रोन/एमएल टेट्रासाइक्लिन तीन चरण के लकीर पैटर्न का उपयोग करके है । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ें। यह क्लोन बैक्टीरिया में लिन-53 dsRNA के आईपीटीजी-निर्भर उत्पादन की अनुमति देता है।
      1. इसके अतिरिक्त, RNAi बैक्टीरिया है कि खाली वेक्टर नियंत्रण के रूप में किसी भी जीन अनुक्रम के बिना L4440 प्लाज्मिड होते हैं ।
   3. अगले दिन, लिन-५३ या खाली वेक्टर पौंड-एगर प्लेटों से एक २०० μL पिपेट टिप का उपयोग कर एक कॉलोनी उठाओ और उनमें से प्रत्येक को एक अलग संस्कृति ट्यूब में टीका लगाता है जिसमें तरल पौंड माध्यम के 2 एमएल होते हैं जो ५० μg/mL carbenicillin के साथ पूरक हैं । 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों को बढ़ाएं जब तक कि वे 0.6 - 0.8 के 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) तक न पहुंच जाएं। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ओडी को मापें।
      सावधानी: तरल पौंड मीडिया में ग्लिसरोल स्टॉक से बैक्टीरिया को लकीर के लिए उपयोग की जाने वाली एलबी-एगर प्लेट के विपरीत टेट्रासाइक्लिन नहीं होना चाहिए, क्योंकि भोजन के दौरान टेट्रासाइक्लिन को शामिल करने से आरएनएआई दक्षता में कमी आती है।
   4. मल्टीपिपेट का उपयोग करके 6 सेमी एनजीएम-एगर आरएनएआई प्लेटों में प्रत्येक बैक्टीरियल कल्चर(लिन-53 या खाली वेक्टर) का 500 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर बंद ढक्कन के साथ इनक्यूबेट प्लेटें सूखने के लिए। इस समय के दौरान, एनजीएम प्लेटों में आईपीटीजी बैक्टीरिया में डीएसआरएनए के उत्पादन को प्रेरित करेगा।
      1. प्रति प्रयोग प्रति बैक्टीरियल कल्चर कम से कम 3 प्लेटों का उपयोग करें। यह प्रत्येक प्रयोग के लिए 3 तकनीकी प्रतिकृति प्रदान करेगा।
   • दो सप्ताह तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया के साथ सूखे एनजीएम-एगर आरएनएआई प्लेटों को स्टोर करें।
3. सी एलिगेंस स्ट्रेन BAT28 की तैयारी
4. 15 डिग्री सेल्सियस पर मानक एनजीएम-एगर प्लेटों का उपयोग कर OP50 बैक्टीरिया पर ट्रांसजीन otIs305 [hsp-16.2prom: चे-1, रोल-6 (su1006)] और ntIs1 [gcy-5prom::gfp]युक्त कीड़ा तनाव BAT28 बनाए रखें ।
   नोट: नेमाटोड संस्कृति पर विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, देखें। रोल-6 (su1006) एक प्रमुख एलील है और आमतौर पर फेनोटाइपिक इंजेक्शन मार्कर¹⁶ का उपयोग किया जाता है जो विशिष्ट रोलिंग आंदोलन का कारण बनता है। इसका उपयोग ओटीआईएस305 ट्रांसजीन में एचएसपी-16.2प्रोम को ट्रैक करने के लिए किया जाता है:: चे-1।
   1. एचएसपी-16.2प्रोम की प्रीकैउटर सक्रियण को रोकने के लिए हर समय 15 डिग्री सेल्सियस पर BAT28 तनाव रखें:: चे-1 ट्रांसजीन। जितना संभव हो तनाव को संभालते हुए 15 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के संपर्क में कम करें।
5. उम्र के लिए कीड़े सिंक्रोनाइज करने के लिए, ब्लीचिंग तकनीक का उपयोग करें।
   1. 900 μL M9 बफर का उपयोग करके BAT28 के वयस्कों और अंडों वाली 6 सेमी एनजीएम-एगर प्लेटों को धोएं। 1 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली कीड़े। सुपरनिट निकालें।
   2. ब्लीचिंग समाधान के 0.5 - 1 एमएल जोड़ें और लगभग 1 मिनट के लिए ट्यूब हिला जब तक वयस्क कीड़े खुले फट शुरू करते हैं। एक मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके मॉनिटर करें।
   3. 1 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली कीड़े। सुपरनिट निकालें।
   4. एम9 बफर के 800 माइक्रोल डालकर 3 बार कीड़ा गोली धोएं और 900 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
   5. OP50 बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त ताजा NGM प्लेटों पर साफ अंडे रखें। 15 डिग्री सेल्सियस पर OP50 बैक्टीरिया पर एक प्रक्षालित आबादी बढ़ो जब तक वे L4 चरण (लगभग 4 दिन) तक पहुंचने । एल 4 लार्वा को एक मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके कीड़े के वेंट्रल साइड के साथ लगभग आधे रास्ते में एक सफेद पैच द्वारा पहचाना जा सकता है।
      नोट: लिन-53की कमी पर न्यूरॉन रूपांतरण फेनोटाइप के लिए रोगाणु कोशिका को प्राप्त करने के लिए, इसे माता-पिता की पीढ़ी (पी0) में समाप्त करने की आवश्यकता है। रूपांतरण फेनोटाइप के लिए स्कोरिंग निम्नलिखित पीढ़ी (संतानीय पीढ़ी F1) में की जाती है। पी0 में पहले से ही समाप्त लिन-53 को प्राप्त करने के लिए, एल 4 जानवरों को आरएनएआई के अधीन किया जाता है।
6. मैन्युअल रूप से एक एनजीएम प्लेट में प्लेटिनम तार का उपयोग करके प्रति दोहराने 50 एल 4 चरण कीड़े स्थानांतरित करें जिसमें कोई बैक्टीरिया नहीं होता है और कीड़े किसी भी स्थानांतरित OP50 बैक्टीरिया से दूर चले जाते हैं। कीड़े को लगभग 5 मिनट तक प्लेट पर चलने दें। संबंधित आरएनएआई प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए पहले लिन-53 आरएनएआई बैक्टीरिया (या खाली वेक्टर नियंत्रण) के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम-एगर आरएनएआई प्लेटों से बैक्टीरिया का उपयोग करें।
   1. वास्तविक आरएनएआई प्लेटों में OP50 बैक्टीरिया स्थानांतरित करने से बचें। 15 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के लिए तनाव के जोखिम समय को कम करने के लिए तेजी से काम करते हैं।
7. एनजीएम-एगर आरएनएआई प्लेटों पर लगभग 7 दिनों तक 15 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े को इनक्यूबेट करें जब तक कि कीड़े की F1 संतान एल 3 - एल 4 चरण तक नहीं पहुंच जाती है। वे स्पष्ट रूप से P0 जानवरों से अलग किया जा सकता है क्योंकि वे बड़े और F1 संतान से मोटा कर रहे हैं ।
   1. एक मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत नेत्रहीन जांच करें कि क्या F1 संतान कीड़े चित्र 1 में दिखाए गए फैला हुआ योनी(पीवीयूल)फेनोटाइप दिखाते हैं। लिन-53 के खिलाफ आरएनएआई के पास प्लियोट्रोपिक प्रभाव हैं और पीवीयूल फेनोटाइप का कारण बनता है जिसका उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि लिन-53 के खिलाफ आरएनएआई सफल रहा है या नहीं।
      नोट:  लिन-५३ के खिलाफ RNAi भी F1 भ्रूण की घातकता का कारण बन सकता है । यह प्रभाव बढ़ जाता है अगर प्लेटें 15 डिग्री सेल्सियस से अधिक डिग्री के संपर्क में आने से पहले जानवरों L3-L4 चरण तक पहुंच रहे हैं । मृत भ्रूण गिरफ्तार विकास और हैचिंग की कमी से पहचाना जा सकता है ।
   2. आईपीटीजी प्रकाश संवेदनशील होने के बाद से अंधेरे में इनक्यूबेट प्लेटें।

Representative Results

चित्रा 1: लिन-53 के खिलाफ आरएनएआई की वजह से पीवीयूल फेनोटाइप। (शीर्ष) L4/युवा वयस्क चरण F1 संतान कीड़े की डीआईसी तस्वीर नियंत्रण या लिन-५३ RNAi इलाज माताओं से प्राप्त कीड़े । स्केल बार = 20 माइक्रोन. (नीचे) लिन-53 आरएनएआई के साथ इलाज किए गए जानवर फैला हुआ योनी(पीवीयूल)फेनोटाइप (काले तीर-सिर) प्रदर्शित करते हैं। पीवीयूल फेनोटाइप इस बात की पुष्टि करता है कि लिन-53 के खिलाफ आरएनएआई सफल रहा। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654