Overview
RNAi 是 C. elegans 研究人员可用的强大遗传工具。本视频介绍了一种利用液体培养条件使用 RNAi 治疗比板喂养更多的蠕虫的方法。
Protocol
该协议是Groh等人的摘录，方法研究与年龄在卡诺哈布迪炎电子人，J.Vis.Exp的固有蛋白质聚合的变化。(2017).
1. 无性腺动物的液体培养，以收集受RNAi攻击的幼年动物，以感兴趣的基因为目标
注： 某些基因对 RNAi 的反应可能与之前描述的温度相关。作为RNAi的替代品，突变基因可以纳入gon-2（-）背景。
- 液体培养细菌的制备
- 准备OP50和RNAi细菌（细菌产生所需的dsRNA和细菌与空载体作为控制）通过接种4 L LB介质与12毫升的各自的细菌培养（添加最终浓度50微克/毫升苯丙林和1mM IPTG到RNAi细菌培养物），并孵育他们在37°C过夜在180 rpm。
- 第二天收获培养物在6，700 x g 10分钟在4°C。 去除超标物，在60mL冰冷S基底介质（100m NaCl，50m磷酸钾pH6，保持在冰上）中再喷出每个颗粒。将三个恢复的颗粒（OP50，控制 RNAi 细菌和 RNAi 细菌以获得感兴趣的基因）保持在 4 °C，直到步骤 1.2。
注： 蠕虫可以在L1阶段的RNAi上生长，也可以避免从上一个幼虫阶段L4中出现发育缺陷（见步骤1.2）。
- 液体培养治疗与 RNAi 开始在最后幼虫阶段 L4
- 在芬巴赫文化烧瓶中添加 200 mL S 基础介质（容量为 2，800 mL）。对于最终培养量为 300 mL（参见 1.2.2.4），请添加 10 mM 柠檬酸钾，pH 6， 3 mL 跟踪金属溶液 （5 m 苯胺乙酸 （EDTA）， 2.5 mM FeSO4，1 mM MnCl2，1 mM ZnSO4，0.1 mM 库索4），3 mM MgSO4，3 mM 卡克2，100 ng/mL 卡本达齐姆， 和5微克/mL胆固醇）。用膜螺丝帽关闭烧瓶。有关缓冲器配方，请参阅表 1。
- 将 L1 从 25 °C 中取出，并将其转移到 15 mL 管中。离心机在1，900 x g 3分钟，去除超标，并计算每2μL的L1。 添加500，000 L1到Fernbach文化烧瓶准备在前一步。
- 将 OP50（从步骤 1.1）按比例添加到蠕虫数量。例如，对于 500，000 蠕虫，添加 60 mL OP50。
- 完整的蠕虫培养与S玄武岩，使总体积达到300 mL。在 150 rpm 的摇晃孵化器中孵育蠕虫培养，直到 L4 阶段达到 25 °C。
- 第二天，蠕虫应该是野生型L4的大小。要从 OP50 变为 RNAi 细菌，请在六个 50 mL 管中收集动物，让它们沉积物并去除超自然物。用 M9 清洗 L4 以去除残留的 OP50 细菌：1900 x g 的离心机 3 分钟，去除超自然物，并将所有 L4 转移到一个 50 mL 管中。计算每 5μL 的 L4（至少 9 次）。年轻蠕虫收集需要两倍于 50，000 L4，老年蠕虫收集需要 2 倍 100，000 L4s。
- 准备四个芬巴赫文化烧瓶，如1.2.2.1所述。在每个烧瓶中加入 50 微克/mL 卡本西林和 1 mM IPTG 的最终浓度。
- 将控制 RNAi 细菌和 RNAi 细菌按比例添加到感兴趣的基因（从步骤 1.1 开始）：为幼虫每瓶添加 7 mL 的相应细菌，为老年蠕虫添加每瓶 14 mL。
- 为幼虫收集添加每瓶 50，000 个蠕虫，为老年蠕虫收集添加每瓶 100，000 个蠕虫，并完成与 S 基底的培养，以填充高达 300 mL。以 25 °C 和 150 rpm 孵育蠕虫培养物（总共 4 个）。
2. 维持C.埃莱甘液体培养物
- 定期从每个液体培养物中收集一个别名，并放置在玻璃滑梯上（或者放在 agar 板上），以验证没有污染。使用解剖显微镜检查培养物中的细菌食物水平，尤其是在生长阶段。提前准备控制 RNAi 细菌和 RNAi 细菌的 2 L 培养物，以了解步骤 1.1 中描述的兴趣基因。如有必要，将这些添加到C. elegans液体培养物中，并将其余的保持在 4 °C。
- 定期检查动物是否无菌。大多数动物不会有性腺。根据gon-2突变的渗透性，有些可能流产了性腺结构，但不应观察到有卵子的动物。
| 库存解决方案 | 量 | 最终浓度 | 评论/说明 |
| S 玄武岩 （500 mL： 5.9 g 纳克， 50 mL 1 M 磷酸钾 pH 6） |
200毫升 | 1 M 磷酸钾 pH 6： 1 L： 129 g KH2PO4 单气， 52 g K2HPO4 二巴氏无水 |
|
| 1 M 柠檬酸钾 pH 6 （400升：13.1克柠檬酸单水合物， 134.4克三钾柠檬酸单水合物） |
3升 | 10米 | |
| 微量金属溶液 （对于 1 L： 1.86 g 乙酰胺乙酰酸 （EDTA）， 0.69 g 费索4 •7 H2O， 0.2 克 MnCl2 •4 H2O， 0.29 g ZnSO4 •7 H2O， 0.025 g 库索4 •5 H2O） |
3升 | 在黑暗中将库存解决方案存储在 4 °C | |
| 1 M mgSO4 （500 mL： 123.3 g） | 900μL | 3米 | |
| 1 M 卡2 （500 mL： 73.5 g） | 900μL | 3米 | |
| 200微克/mL 卡本达齐姆 （50毫升：甲醇10毫克） |
150μL | 100 ng/mL | |
| 5毫克/毫升胆固醇 （100毫升：乙醇0.5克） |
300μL | 5微克/升 |
表1。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1E+06 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | yes |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 3E+05 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 3E+05 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | no |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 5E+09 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 5E+09 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4E+06 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5E+09 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 6E+09 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 8E+07 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5E+09 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | no |
| E.coli strains | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
