RNAi Alimentación en cultivo líquido: Un método de alto rendimiento para derribar la expresión génica en C. elegans

Overview

RNAi es una poderosa herramienta genética disponible para los investigadores de C. elegans. Este video introduce un método para tratar más gusanos con RNAi que la alimentación de placas mediante la utilización de condiciones de cultivo líquido.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Groh et al, Métodos para estudiar los cambios en la agregación de proteínas inherentes con edad en Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Cultivo líquido de animales sin gónada para recoger animales jóvenes y envejecidos sometidos a RNAi dirigidos a un gen de interés

NOTA: La respuesta de algunos genes a los RNAi puede depender de la temperatura como se describió anteriormente. Como alternativa a los ISR, un gen mutante podría incorporarse al fondo gon-2(-).

1. Preparación de bacterias para cultivo líquido
   1. Preparar las bacterias OP50 y RNAi (bacterias que producen el dsRNA y bacterias deseadas con el vector vacío como control) inoculando el medio de 4 L LB con 12 ml del cultivo bacteriano respectivo (añadir una concentración final de 50 μg/ml de carbenicilina y 1 mM IPTG a los cultivos bacterianos RNAi) e incubarlos a 37 °C durante la noche a 180 rpm.
   2. Al día siguiente cosecha los cultivos a 6.700 x g durante 10 minutos a 4 °C. Retire los sobrenautas y vuelva a gastar cada pellet en medios basales S fríos en hielo de 60 ml (100 mM NaCl, 50 mM de fosfato de potasio pH 6, mantenido en hielo). Mantenga los tres pellets resuspended (OP50, controlar la bacteria RNAi y la bacteria RNAi para el gen de interés) a 4 °C hasta el paso 1.2.
      NOTA: Los gusanos se pueden cultivar en RNAi desde la etapa L1 o para evitar defectos de desarrollo de la última etapa larvaria L4 (ver paso 1.2).
2. Cultivo líquido para tratamiento con RNAi a partir de la última etapa larvaria L4
   1. Añadir 200 mL S medios basales en un matraz de cultivo Fernbach (capacidad 2.800 mL). Para un volumen de cultivo final de 300 mL (véase 1.2.2.4), agregue 10 mM de citrato de potasio, pH 6, Solución de metales Trace de 3 ml (ácido etilenodiaminetetraacetic de 5 mM (EDTA), 2,5 mM FeSO_4,1 mM MnCl_2,1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO_4,3 mM CaCl_2,100 ng/mL carbendazim, y 5 μg/mL colesterol). Cierre el matraz con una tapa de tornillo de membrana. Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de búferes.
   2. Tome los L1 de 25 °C y transfiérelos a tubos de 15 ml. Centrífuga a 1.900 x g durante 3 minutos, retire el sobrenadante y cuente los L1 por 2 μL. Agregue 500.000 L1s en el matraz de cultivo Fernbach preparado en el paso anterior.
   3. Agregue OP50 (desde el paso 1.1) proporcionalmente al número de gusanos. Por ejemplo, para 500.000 gusanos añadir 60 mL OP50.
   4. Cultivo de gusano completo con basal S para llevar el volumen total a 300 mL. Incubar el cultivo de gusanos hasta la etapa L4 a 25 °C en una incubadora temblorosa con 150 rpm.
   5. Al día siguiente, los gusanos deben ser del tamaño de L4 de tipo salvaje. Para cambiar de la bacteria OP50 a la bacteria RNAi, recoger animales en seis tubos de 50 ml, dejar que sedimenten y eliminar el sobrenadante. Lave los L4 con M9 para eliminar las bacterias OP50 residuales: centrífuga a 1900 x g durante 3 minutos, retire el sobrenadante y transfiera todos los L4 en un tubo de 50 ml. Cuente los L4 por 5 μL (al menos nueve veces). Se necesitan dos veces 50.000 L4 para la colección de gusanos jóvenes y se necesitan dos veces 100.000 L4 para la recolección de gusanos envejecidos.
   6. Prepare cuatro frascos de cultivo Fernbach como se describe en 1.2.2.1. Añadir también una concentración final de 50 μg/mL carbenicilina y 1 mM IPTG a cada matraz.
   7. Añadir control de bacterias RNAi y bacterias RNAi para el gen de interés (desde el paso 1.1) proporcionalmente al número de gusanos: Añadir 7 ml de las bacterias respectivas por matraz para gusanos jóvenes y 14 ml por matraz para los gusanos envejecidos.
   8. Añade 50.000 gusanos por matraz para la colección de gusanos jóvenes y 100.000 gusanos por matraz para la colección de gusanos envejecidos, y completa las culturas con S basal para llenar hasta 300 ml. Incubar los cultivos de gusanos (cuatro en total) a 25 °C y 150 rpm.

2. Mantenimiento de cultivos líquidos C. elegans

1. Recoger periódicamente una alícuota de cada cultivo líquido y colocar en un tobogán de vidrio (alternativamente en una placa de agar) para verificar que no hay contaminación. Utilizando un microscopio de disección, compruebe los niveles de alimentos bacterianos en el cultivo, especialmente durante la fase de crecimiento. Preparar de antemano 2 cultivos L de control de bacterias RNAi y bacterias RNAi para el gen de interés como se describe en el paso 1.1. Agréguelos a cultivos líquidos C. elegans si es necesario y mantenga el resto a 4 °C.
2. Compruebe periódicamente que los animales son estériles. La mayoría de los animales no tendrán gonad. Dependiendo de la penetrancia de la mutación gon-2, algunos pueden haber abortado estructuras gonadales, pero no se deben observar animales con huevos.

Solución de stock	importe	Concentración final	Comentarios/Descripción
S basal (Para 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Fosfato de potasio pH 6)	200 mL		1 M Fosfato de potasio pH 6: Para 1 L: 129 g KH2PO4 monobásico, 52 g de K2HPO4 dibásico anhidro
1 M Citrato de potasio pH 6 (Para 400 ml: 13,1 g de ácido cítrico monohidrato, 134,4 g de citrato tri-potásico monohidrato)	3 ml	10 mM
Solución de trazas metálicas (Para 1 L: 1,86 g de ácido etilenodiaminetetraacetic (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Almacene la solución de stock en la oscuridad a 4 °C
1 M MgSO4 (Para 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (Para 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
Carbendazim de 200 μg/ml (Para 50 mL: 10 mg en metanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL colesterol (Para 100 mL: 0,5 g en etanol)	300 μL	5 μg/ml

Tabla 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]