Analyse olfactomètre à quatre sens : une méthode pour évaluer les réponses odorantes-cued à Drosophila

Overview

Les mouches des fruits ont un système olfactif complexe, peuvent discriminer des centaines d’odorants et utiliser leur odorat pour diriger les décisions comportementales. Cette vidéo décrit l’analyse olfactomètre à quatre sens, une méthode pour étudier les réponses comportementales olfactives chez les mouches. Le clip de protocole en vedette montre comment gérer les mouches d’essai et quelles sont les étapes critiques lors de l’exécution de l’analyse.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Lin et coll., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Réponses comportementales auxodorants attrayants et répulsifs

1. Allumez le contrôleur de température et réglez-le à 25 °C.
2. Connectez les chambres odorantes (contrôle et test odorants) en insérant le tube à la sortie de la chambre odorante et au raccord push-to-connect sur la boîte de comportement.
3. Vérifiez le débit dans chaque quadrant en utilisant le compteur de flux d’air pour vous assurer que les flux d’air de commande et d’odorant sont égaux à 100 ml/min.
4. Nettoyez l’arène de vol PTFE et les plaques de verre avec 70% d’éthanol 2-3 fois et laissez-leur sécher complètement à l’air (~3-4 min).
5. Apposer les plaques de verre à l’arène avec des pinces.
6. Transférer les mouches sans_{anesthésie co 2} dans l’arène à travers le trou dans l’une des plaques de verre. Après le transfert, placez un maillage circulaire sur le trou pour empêcher les mouches de s’échapper.
   REMARQUE: L’anesthésie de CO₂ a été montrée pour affecter le comportement de Drosophila et ne devrait pas être employée dans les 24 heures d’une expérience comportementale.
7. Placez l’arène avec des mouches dans la chambre étanche à la lumière, connectez les quatre flux d’air de commande en reliant le tube attaché au raccord push-to-connect sur la boîte de comportement aux coins de l’arène, fermez la porte de la chambre et attendez 10-15 min pour laisser les mouches s’acclimater au nouvel environnement. Si possible, éteignez les lumières dans la pièce où les expériences sont effectuées, afin d’éviter une fuite de lumière minimale possible qui peut biaiser le résultat expérimental.
8. Exécutez une expérience de contrôle de 5 à 10 minutes, au cours de laquelle les mouches sont exposées à 4 flux d’air de contrôle.
9. Analyser les données immédiatement (voir la section analyse des données ci-dessous) pour vous assurer que les mouches sont distribuées uniformément dans l’arène, et que l’indice d’attraction est proche de 0. Cette étape est essentielle, car elle vérifie qu’il n’y a pas de sources incontrôlées de préférence ou d’évitement dans l’arène(p. ex. fuite de lumière de l’extérieur, répartition inégale des températures, arène inégale, contamination des odeurs, etc.). Si les mouches sont réparties inégalement ou si leur activité locomotrice est faible, jetez les mouches, nettoyez à nouveau l’arène (étape 1.4) et utilisez un nouveau lot de mouches pour répéter l’expérience.
10. Connectez la chambre d’odorant d’essai à la configuration en allumant les vannes à 3 ou en rebrancher les tubes du connecteur.
11. Exécutez l’expérience de test pendant 5-10 min et analysez les données telles que discutées dans la section 2 ci-dessous (Figure 1). Les enregistrements de plus de 20 min peuvent donner lieu à des fichiers de données qui peuvent être difficiles à traiter par calcul. Si des enregistrements expérimentaux plus longs sont souhaités, arrêtez et redéd commencez rapidement le programme de suivi. Il en résulte un écart d’environ 10 secondes entre les enregistrements expérimentaux.
12. Jetez les mouches.
13. Nettoyez l’arène et les plaques de verre avec 70 % d’éthanol (étape 1.4) et remplacez les tubes de connecteur dans l’enceinte étanche à la lumière. Pour accélérer les expériences, une nouvelle arène propre peut être utilisée, et l’arène sale nettoyée tout en effectuant des courses expérimentales.
14. Exécutez une autre expérience avec un nouveau lot de mouches, si nécessaire. Si plusieurs expériences sont menées le même jour, prenez grand soin de vous assurer qu’aucun odorant n’est laissé dans le système à partir d’un essai précédent. Ce n’est normalement pas un problème avec de faibles concentrations d’odorants ou avec le CO₂, mais pour les stimuli hautement concentrés jusqu’à un écart de 24 heures entre les courses expérimentales peuvent être nécessaires. En outre, tous les tubes après les tubes d’écoulement peuvent être remplacés si la contamination par les odorants est suspectée lors d’expériences de contrôle. Laissez toujours l’air sec entre les expériences pour rincer continuellement le système.

2. Analyse des données

REMARQUE: Le logiciel d’acquisition de suivi des mouches suggéré (détaillé dans Materials), suit les mouches en temps réel lors de l’acquisition, et enregistre l’horodatage et les coordonnées de toutes les mouches détectées dans * .dat format. Nous avons développé une routine Matlab sur mesure pour convertir les données en format Matlab et analyser les données. Des exemples de code sont fournis dans les documents supplémentaires, mais les détails de la mise en œuvre dépendront du logiciel utilisé pour l’acquisition de données.

1. Chargez les données brutes. Créez un masque spatial qui suit les contours de l’arène et appliquez le masque sur les données brutes pour supprimer tous les points de données qui tombent en dehors de l’arène car ils représentent le bruit (figure 2A, Code supplémentaire MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Supprimez tous les points de données qui se déplacent à une vitesse inférieure à 0,163 cm/s pendant plus de 3 s, car ces données sont susceptibles d’être du bruit ou générées par des mouches non mobiles(figure 2B, Code supplémentaire TemporalFiltering.m).
3. Visualisez les points de données restants en les traçant tous en même temps ou sous forme de trajectoires individuelles(figure 1, Code supplémentaire SingleTrajectoryViewer.m).
   REMARQUE: L’emplacement des limites d’odeur dans les quatre champs dépend probablement d’un certain nombre de facteurs, tels que les caractéristiques de chaque odorant et les taux de flux d’air utilisés. Par exemple, les odorants hautement volatils rempliront probablement le quadrant des odeurs plus complètement que les odorants moins volatils. Ainsi, il est probable que chaque odorant peut présenter des limites d’odeur légèrement différentes. L’utilisation d’un détecteur de photoionisation pour mesurer les limites des odeurs peut être problématique car il utilise un vide pour échantillonner l’air à partir d’un endroit particulier, et perturbe ainsi la concentration d’odorant à cet endroit. Néanmoins, les limites des odeurs peuvent être rapidement estimées à partir de données comportementales à la mouche. Par exemple, une limite d’odeur s’appuyant sur des pistes de mouche cumulées en réponse à différentes odeurs peut être clairement observée dans les figures 1C et 1D.
4. Calculez un indice d’attraction pour déterminer si les expériences de contrôle ne génèrent aucune réponse de préférence, et aussi pour accéder à la réponse à un stimulus odorant (ou optogénétique). Pour calculer un indice d’attraction (IA), utilisez les 5 dernières minutes d’un enregistrement de contrôle ou de test. Pour obtenir une mesure d’attraction comprise entre +1 (attraction absolue) et -1 (répulsion absolue), la formule suivante est utilisée pour calculer l’IA :
   
   lorsque le_test N est le nombre de points de données dans le quadrant de test, le contrôle N_est le nombre moyen de points de données dans les trois quadrants de contrôle. Cette mesure est intuitive car aucune préférence ne serait indiquée par des valeurs proches de zéro. Toutefois, il n’indique pas correctement la proportion du nombre total de mouches qui se trouvent dans le quadrant des odorants. Pour obtenir cette mesure, un indice de pourcentage (IP) peut être utilisé :
   
   où _{le test} N est le nombre de points de données dans le quadrant de test, et le _total N est le nombre total de points de données dans les quatre quadrants. Cette formule fournit une mesure qui se situe entre 0 et 1, avec 0,25 correspondant à aucune préférence comportementale(figure 1E et 2C, Code supplémentaire AttractionIndex.m).
5. Exécutez de 5 à 10 répétitions de chaque condition expérimentale, à l’aide d’un nouveau groupe de mouches pour chaque répétition. Comparez les indices d’attraction entre les conditions ou contre les contrôles en utilisant le test non paramétrique Kolmogorov-Smirnov(figure 1F, fonction kstest2 dans Matlab).

Representative Results

Figure 1 : Exemples de données générées à l’aide d’un essai olfactif à quatre champs. (A) Schéma de l’arène à quatre champs. (B) Des réponses neutres sont observées lorsque les quatre quadrants ne contiennent que de la perfusion d’air sec. (C) Réponses d’attraction à une dilution de 6,25 % du vinaigre de cidre de pomme perfusé du quadrant supérieur gauche. (D) Comportements de répulsion déclenchés par propionate éthylique de 10%. Dans la figure 2B-2D, une trajectoire unique à partir des données acquises est tracée. Un gradient de couleur est utilisé pour signifier le cours du temps d’enregistrement, avec des couleurs bleues et rouges étant le début et la fin des enregistrements, respectivement. (E) Comparaison de l’indice d’attraction (IA) et de l’indice de pourcentage (IP). (F) IA moyenne de 3- 6 expériences sans odeur (contrôle), vinaigre de cidre de pomme (ACV) et 10% Propionate éthylique (EP). Les barres d’erreur indiquent la SEM. La différence statistique a été évaluée par le test Kolmogorov-Smirnov. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Exemples de données générées par les étapes d’analyse des données. (A) Filtrage spatial des données, effectué par MaskSpatialFiltering.m supprimer les points de données qui tombent en dehors de l’arène. Les cercles rouges affichent les positions initiales des cercles qui sont utilisés pour définir les bordures de l’arène. Les cercles noirs sont les positions finales, acquises en adaptant les contours circulaires aux données (zone grise ombragée à l’intérieur du champ quatre). Les points rouges et les pointes de flèches noires indiquent les points de données qui seront supprimés du jeu de données après cette étape de filtrage. (B) Filtrage temporel des données, effectué par TemporalFiltering.m. Cette étape de filtrage supprime les points de données qui se déplacent très lentement ou pas du tout, car ils sont susceptibles d’être générés par des mouches non mobiles ou par la saleté / réflexions de l’arène. Un point rouge entouré d’une boîte rouge pointillée indique des positions d’environ 6 000 points de données avec des coordonnées identiques qui seront supprimées par cette étape de filtrage. (C) Indice d’attraction (IA) et indice de pourcentage (PI), calculé en bacs de 10 secondes au cours des 5 dernières minutes d’une expérience par AttractionIndex.m. Les profils temporels de ces index contiennent des informations sur la dynamique des réponses comportementales et peuvent être utilisés pour une analyse détaillée des comportements. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fichier code supplémentaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Cliquez à droite pour télécharger).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1