Vier-Wege-Olfactometer-Assay: Eine Methode zur Bewertung von Odorant-Cued-Responses in Drosophila

Overview

Fruchtfliegen haben ein komplexes Geruchssystem, können Hunderte von Geruchsstoffen diskriminieren und ihren Geruchssinn nutzen, um Verhaltensentscheidungen zu lenken. Dieses Video beschreibt den Vier-Wege-Olfactometer-Assay, eine Methode, um olfaktorische Verhaltensreaktionen bei Fliegen zu untersuchen. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie man mit Testfliegen umgeht und welche kritischen Schritte beim Durchführen des Tests sind.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Verhaltensreaktionen auf attraktive und abweisende Geruchsstoffe

1. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie ihn auf 25 °C ein.
2. Verbinden Sie die Geruchskammern (Steuer- und Prüfgeruchsstoffe) durch Einsetzen der Schläuche an den Auslass der Geruchskammer und an die Push-to-Connect-Befestigung an der Verhaltensbox.
3. Überprüfen Sie den Durchfluss in jedem Quadranten, indem Sie den Luftstrommesser verwenden, um sicherzustellen, dass die Steuer- und Geruchsluftströme 100 ml/min entsprechen.
4. Reinigen Sie die PTFE-Fliegenarena und die Glasplatten mit 70% Ethanol 2-3 mal und lassen Sie sie vollständig lufttrocknen (ca. 3-4 min).
5. Befestigen Sie die Glasplatten mit Klammern an der Arena.
6. Transferfliegen ohne CO2-Anästhesie durch das Loch in einer der Glasplatten in die Arena. Legen Sie nach der Übertragung ein kreisförmiges Netz auf das Loch, um zu verhindern, dass Fliegen entkommen.
   HINWEIS: Es hat sich gezeigt, dass die CO2-Anästhesie das Drosophila-Verhalten beeinflusst und sollte nicht innerhalb von 24 Stunden eines Verhaltensexperiments angewendet werden.
7. Platzieren Sie die Arena mit Fliegen in die lichtdichte Kammer, verbinden Sie die vier Steuerluftströme, indem Sie die Schläuche, die an der Push-to-Connect-Befestigung an der Verhaltensbox befestigt sind, mit den Arena-Ecken verbinden, schließen Sie die Tür der Kammer und warten Sie 10-15 min, um die Fliegen an die neue Umgebung gewöhnen zu lassen. Schalten Sie nach Möglichkeit die Lichter in dem Raum aus, in dem die Experimente durchgeführt werden, um ein mögliches minimales Lichtleck zu vermeiden, das das experimentelle Ergebnis verzerrt.
8. Führen Sie ein 5-10 min Kontrollexperiment durch, bei dem Fliegen 4 Kontrollluftströmen ausgesetzt sind.
9. Analysieren Sie die Daten sofort (siehe Abschnitt Datenanalyse unten), um sicherzustellen, dass die Fliegen gleichmäßig in der Arena verteilt sind und der Attraktionsindex nahe 0 ist. Dieser Schritt ist von wesentlicher Bedeutung, da er überprüft, dass es keine unkontrollierten Präferenz- oder Vermeidungsquellen innerhalb der Arena gibt(z. B. Licht, das von außen austritt, ungleichmäßige Temperaturverteilung, ungleichmäßige Arena, Geruchskontamination usw.). Wenn die Fliegen ungleich verteilt sind oder ihre Aktivität des Bewegungsapparates gering ist, entsorgen Sie die Fliegen, reinigen Sie die Arena erneut (Schritt 1.4) und verwenden Sie eine neue Charge von Fliegen, um das Experiment zu wiederholen.
10. Schließen Sie die Testgeruchskammer an das Setup an, indem Sie die 3-Wege-Ventile einschalten oder die Steckverbinderrohre wieder anschließen.
11. Führen Sie das Testexperiment für 5-10 min aus und analysieren Sie die Daten, wie in Abschnitt 2 unten (Abbildung 1) beschrieben. Aufnahmen, die länger als 20 min sind, können zu Datendateien führen, die möglicherweise schwer rechnerisch verarbeitet werden können. Wenn längere experimentelle Aufnahmen gewünscht werden, stoppen Sie das Tracking-Programm schnell und starten Sie es neu. Dies führt zu einem Abstand von 10 Sek. zwischen experimentellen Aufnahmen.
12. Entsorgen Sie Fliegen.
13. Reinigen Sie Arena- und Glasplatten mit 70 % Ethanol (Schritt 1.4) und ersetzen Sie Dieverbinder rohre innerhalb des lichtdichten Gehäuses. Um Experimente zu beschleunigen, kann eine neue saubere Arena verwendet und die schmutzige Arena während der Durchführung experimenteller Läufe gereinigt werden.
14. Führen Sie bei Bedarf ein weiteres Experiment mit einer neuen Charge von Fliegen aus. Wenn mehrere Experimente am selben Tag durchgeführt werden, achten Sie darauf, dass aus einem vorherigen Testlauf kein Geruchsmittel im System zurückbleibt. Dies ist normalerweise kein Problem mit niedrigen Geruchskonzentrationen oder mit_CO2, aber für hochkonzentrierte Reize bis zu einem Abstand von 24 Stunden zwischen experimentellen Läufen kann erforderlich sein. Darüber hinaus können alle Schläuche nach den Durchflussrohren ausgetauscht werden, wenn bei Kontrollexperimenten ein Geruchsbelästigung vermutet wird. Lassen Sie die trockene Luft immer zwischen den Experimenten an, um das System kontinuierlich zu spülen.

2. Datenanalyse

HINWEIS: Die vorgeschlagene Fly-Tracking-Erfassungssoftware (in Materialien detailliert) verfolgt Fliegen in Echtzeit während der Erfassung und spart den Zeitstempel und die Koordinaten aller erkannten Fliegen im *.dat Format. Wir haben eine maßgeschneiderte Matlab-Routine entwickelt, um die Daten in ein Matlab-Format zu konvertieren und die Daten zu analysieren. Codebeispiele finden Sie in Ergänzenden Materialien, aber Details der Implementierung hängen von der Software ab, die für die Datenerfassung verwendet wird.

1. Laden Sie die Rohdaten. Erstellen Sie eine räumliche Maske, die den Konturen der Arena folgt, und wenden Sie die Maske auf die Rohdaten an, um alle Datenpunkte zu entfernen, die außerhalb der Arena liegen, da sie Rauschen darstellen(Abbildung 2A, Ergänzende CodemaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Entfernen Sie alle Datenpunkte, die sich länger als 3 s mit einer Geschwindigkeit unter 0,163 cm/s bewegen, da diese Daten wahrscheinlich rauschen oder von nicht beweglichen Fliegen erzeugt werden(Abbildung 2B, Ergänzende Code-Temporalfiltering.m).
3. Visualisieren Sie verbleibende Datenpunkte, indem Sie sie alle auf einmal oder als einzelne Flugbahnen auszeichnen (Abbildung 1, Supplementary Code SingleTrajectoryViewer.m).
   HINWEIS: Die Lage der Geruchsgrenzen im Vierfeld hängt wahrscheinlich von einer Reihe von Faktoren ab, wie z. B. den Eigenschaften jedes Geruchsmittels und den verwendeten Luftstromraten. Zum Beispiel werden hochflüchtige Geruchsstoffe den Geruchsquadranten wahrscheinlich vollständiger füllen als weniger flüchtige Geruchsstoffe. Daher ist es wahrscheinlich, dass jedes Geruchsmittel leicht unterschiedliche Geruchsgrenzen aufweisen kann. Die Verwendung eines Photoionisationsdetektors zur Messung von Geruchsgrenzen kann problematisch sein, da er ein Vakuum verwendet, um Luft von einem bestimmten Punkt zu proben, und so die Geruchskonzentration an dieser Stelle stört. Dennoch können Geruchsgrenzen schnell auf der Grundlage von Flugverhaltensdaten geschätzt werden. Beispielsweise kann eine Geruchsgrenze, die auf kumulierten Flugbahnen als Reaktion auf unterschiedliche Gerüche basiert, in Abbildung 1C und 1Ddeutlich beobachtet werden.
4. Berechnen Sie einen Anziehungsindex, um zu bestimmen, ob Kontrollexperimente keine Präferenzantwort erzeugen, und auch um auf die Reaktion auf einen Geruchsreiz (oder optogenetischen) Stimulus zuzugreifen. Um einen Attraction Index (AI) zu berechnen, verwenden Sie die letzten 5 min einer Steuerelement- oder Testaufzeichnung. Um ein Maß an Anziehung zu erhalten, das zwischen +1 (absolute Anziehung) und -1 (absolute Abstoßung) liegt, wird die folgende Formel verwendet, um die KI zu berechnen:
   
   Wobei _N-Test die Anzahl der Datenpunkte im Testquadranten ist, ist _{N-Steuerelement} die durchschnittliche Anzahl von Datenpunkten in den drei Steuerquadranten. Diese Kennzahl ist intuitiv, da keine Präferenz durch Nahe Nullwerte angezeigt wird. Es gibt jedoch nicht korrekt den Anteil der Gesamtzahl der Fliegen an, die sich im Geruchsquadranten befinden. Um diese Kennzahl zu erhalten, kann ein Prozentsatz (PI) verwendet werden:
   
   wobei _N-Test die Anzahl der Datenpunkte im Testquadranten und N_insgesamt die Gesamtzahl der Datenpunkte in allen vier Quadranten ist. Diese Formel stellt eine Kennzahl bereit, die zwischen 0 und 1 liegt, wobei 0,25 keiner Verhaltenspräferenz entspricht(Abbildung 1E und 2C, Supplementary Code AttractionIndex.m).
5. Führen Sie 5-10 Wiederholungen jeder experimentellen Bedingung aus, wobei eine neue Gruppe von Fliegen für jede Wiederholung verwendet wird. Vergleichen Sie die Anziehungsindizes zwischen Bedingungen oder mit Kontrollen mit dem nicht-parametrischen Test Kolmogorov-Smirnov(Abbildung 1F, kstest2-Funktion in Matlab).

Representative Results

Abbildung 1: Beispieldaten, die mit einem Vierfeld-Olfaktor-Assay generiert wurden. (A) Schemader der Vierfeldarena. (B) Neutrale Reaktionen werden beobachtet, wenn alle vier Quadranten nur trockene Luftdurchblutung enthalten. (C) Anziehungsreaktionen auf eine Verdünnung von Apfelessig von 6,25 % durchsetzt aus dem linken oberen Quadranten. (D) Abstoßungsverhalten, ausgelöst durch 10% Ethylpropionat. In Abbildung 2B-2D wird eine einzelne Flugbahn aus den erfassten Daten dargestellt. Ein Farbverlauf wird verwendet, um den Zeitverlauf der Aufnahme zu bezeichnen, wobei blaue und rote Farben jeweils der Anfang bzw. das Ende der Aufnahmen sind. (E) Vergleich des Attraction Index (AI) und des Percentage Index (PI). (F) Durchschnittliche KI-Experimente von 3- 6 Experimenten ohne Geruch (Kontrolle), Apfelessig (ACV) und 10% Ethylpropionat (EP). Fehlerbalken zeigen SEM an. Die statistische Differenz wurde durch den Kolmogorov-Smirnov-Test ausgewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispieldaten, die durch die Datenanalyseschritte generiert werden. (A) Räumliche Filterung der Daten, die von MaskSpatialFiltering durchgeführt wird.m, um Datenpunkte zu entfernen, die außerhalb der Arena liegen. Rote Kreise zeigen Anfangspositionen der Kreise, die verwendet werden, um die Grenzen der Arena zu definieren. Schwarze Kreise sind die endgültigen Positionen, die durch Anpassen der Kreisumrisse an die Daten (grau schattierter Bereich innerhalb des Vierfeldes) erfasst werden. Rote Punkte und schwarze Pfeilspitzen zeigen Datenpunkte an, die nach diesem Filterschritt aus dem Dataset entfernt werden. (B) Zeitliche Filterung von Daten, durchgeführt von TemporalFiltering.m. Dieser Filterschritt entfernt Datenpunkte, die sich sehr langsam oder gar nicht bewegen, da sie wahrscheinlich durch nicht bewegte Fliegen oder durch Schmutz/Reflexionen aus der Arena erzeugt werden. Ein roter Punkt, der von einem gestrichelten roten Feld umgeben ist, zeigt Positionen von 6.000 Datenpunkten mit identischen Koordinaten an, die durch diesen Filterschritt entfernt werden. (C) Attraction Index (AI) und Percentage Index (PI), berechnet in 10-Sekunden-Abschnitten in den letzten 5 min eines Experiments von AttractionIndex.m. Zeitliche Profile dieser Indizes enthalten Informationen über die Dynamik von Verhaltensreaktionen und können für eine detaillierte Analyse von Verhaltensweisen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Codedatei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1