Overview
Moscas frutíferas têm um sistema olfativo complexo, podem discriminar centenas de odores, e usar seu olfato para direcionar decisões comportamentais. Este vídeo descreve o ensaio de fatoômetro de quatro vias, um método para estudar respostas comportamentais olfativas em moscas. O clipe de protocolo em destaque mostra como lidar com moscas de teste e quais são etapas críticas durante a execução do ensaio.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).
1. Respostas comportamentais a odores atraentes e repelentes
- Ligue o controlador de temperatura e coloque-o a 25 °C.
- Conecte as câmaras odorantes (odores de controle e teste) inserindo a tubulação na saída da câmara odoante e ao encaixe push-to-connect na caixa de comportamento.
- Verifique a vazão em cada quadrante usando o medidor de fluxo de ar para certificar-se de que as correntes aéreas de controle e odorante são iguais a 100 ml/min.
- Limpe a arena de moscas PTFE e as placas de vidro com 70% de etanol 2-3 vezes e deixe-as secar totalmente (~3-4 min).
- Fixar as placas de vidro na arena com grampos.
- Transfira moscas sem anestesia de CO2 para a arena através do buraco em uma das placas de vidro. Após a transferência, coloque uma malha circular no orifício para evitar que as moscas escapem.
NOTA: A anestesia de CO2 tem sido demonstrada para afetar o comportamento de Drosophila e não deve ser usada dentro de 24 horas de um experimento comportamental. - Coloque a arena com moscas na câmara apertada, conecte os quatro fluxos de ar de controle conectando o tubo ligado ao encaixe push-to-connect na caixa de comportamento para os cantos da arena, feche a porta da câmara e espere 10-15 minutos para deixar as moscas se aclimatar ao novo ambiente. Se possível, desligue as luzes na sala onde os experimentos são realizados, para evitar possíveis vazamentos mínimos de luz que possam influenciar o resultado experimental.
- Execute um experimento de controle de 5 a 10 minutos, no qual as moscas são expostas a 4 correntes de ar de controle.
- Analise os dados imediatamente (consulte a seção de análise de dados abaixo) para garantir que as moscas sejam distribuídas uniformemente na arena, e o Índice de Atração está próximo de 0. Esta etapa é essencial, pois verifica que não há fontes descontroladas de preferência ou evasão dentro da arena (por exemplo, vazamento de luz do lado de fora, distribuição de temperatura irregular, arena irregular, contaminação do odor, etc.). Se as moscas forem distribuídas de forma desigual ou sua atividade locomotor estiver baixa, descarte as moscas, limpe a arena novamente (Passo 1.4) e use um novo lote de moscas para repetir o experimento.
- Conecte a câmara de odorante de teste à configuração ligando as válvulas de 3 vias ou reectando os tubos do conector.
- Execute o experimento de teste por 5-10 min e analise os dados conforme discutido na seção 2 abaixo (Figura 1). Gravações com mais de 20 minutos podem resultar em arquivos de dados que podem ser difíceis de processar computacionalmente. Se forem desejadas gravações experimentais mais longas, pare e reinicie rapidamente o programa de rastreamento. Isso resulta em uma diferença de ~10 segundos entre gravações experimentais.
- Descarte moscas.
- Limpe as placas de arena e vidro com 70% de etanol (Passo 1.4) e substitua os tubos do conector dentro do gabinete apertado. Para agilizar experimentos, uma nova arena limpa pode ser usada, e a arena suja limpa durante a realização de corridas experimentais.
- Execute outro experimento com um novo lote de moscas, se necessário. Se vários experimentos forem executados no mesmo dia, tome muito cuidado para garantir que nenhum odorante seja deixado no sistema de um teste anterior. Este normalmente não é um problema com baixas concentrações de odores ou com CO2,mas para estímulos altamente concentrados até uma diferença de 24 horas entre corridas experimentais pode ser necessário. Além disso, todos os tubos após os tubos de fluxo podem ser substituídos se suspeitar de contaminação odonte durante experimentos de controle. Deixe sempre o ar seco entre os experimentos para lavar continuamente o sistema.
2. Análise de dados
NOTA: O software sugerido de aquisição de rastreamento de moscas (detalhado em Materiais), rastreia moscas em tempo real durante a aquisição, e economiza o carimbo de tempo e coordenadas de todas as moscas detectadas em *.dat formato. Desenvolvemos uma rotina matlab personalizada para converter os dados em um formato Matlab e analisar os dados. Exemplos de código são fornecidos em Materiais Suplementares, mas os detalhes da implementação dependerão do software utilizado para aquisição de dados.
- Carregue os dados brutos. Crie uma máscara espacial que siga os contornos da arena e aplique a máscara aos dados brutos para remover todos os pontos de dados que caem fora da arena à medida que representam ruído (Figura 2A, Máscara de Código SuplementarSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
- Remova todos os pontos de dados que se movem a uma velocidade inferior a 0,163 cm/s por mais de 3s, pois esses dados provavelmente são ruídos ou gerados por moscas não em movimento(Figura 2B, Código Suplementar TemporalFiltering.m).
- Visualize os pontos de dados restantes, plotando-os todos de uma só vez ou como trajetórias únicas(Figura 1, Código Suplementar SingleTrajectoryViewer.m).
NOTA: A localização dos limites do odor no campo de quatro campos provavelmente depende de uma série de fatores, como as características de cada odor e as taxas de fluxo de ar que estão sendo utilizadas. Por exemplo, odores altamente voláteis provavelmente encherão o quadrante de odor mais plenamente do que odores menos voláteis. Assim, é provável que cada odor possa exibir limites ligeiramente diferentes do odor. O uso de um detector de fotoionização para medir os limites do odor pode ser problemático, pois usa um vácuo para provar o ar de um determinado ponto, e assim interrompe a concentração de odor naquele local. No entanto, os limites do odor podem ser rapidamente estimados com base em dados comportamentais de moscas. Por exemplo, um limite de odor baseado em faixas de moscas acumuladas em resposta a diferentes odores pode ser claramente observado nas Figuras 1C e 1D. - Calcule um índice de atração para determinar se os experimentos de controle não geram resposta de preferência, e também para acessar a resposta a um estímulo odorante (ou optogenético). Para calcular um Índice de Atração (IA), use os últimos 5 minutos de um controle ou gravação de teste. Para obter uma medida de atração que cai entre +1 (atração absoluta) e -1 (repulsa absoluta), a seguinte fórmula é usada para calcular a IA:
onde nteste é o número de pontos de dados no quadrante de teste, ncontrole é o número médio de pontos de dados nos três quadrantes de controle. Esta medida é intuitiva, pois nenhuma preferência seria indicada por valores próximos a zero. No entanto, não indica corretamente a proporção do número total de moscas que estão localizadas no quadrante odorante. Para obter essa medida, pode-se utilizar um Índice percentual (PI):
onde nteste é o número de pontos de dados no quadrante de teste, e Ntotal é o número total de pontos de dados em todos os quatro quadrantes. Esta fórmula prevê uma medida que cai entre 0 e 1, sendo 0,25 correspondente à falta de preferência comportamental(Figura 1E e 2C, Atrações de Código SuplementarIndex.m). - Execute 5-10 repetições de cada condição experimental, usando um novo grupo de moscas para cada repetição. Compare os índices de atração entre condições ou contra controles usando o teste não paramétrico de Kolmogorov-Smirnov(Figura 1F, função kstest2 em Matlab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1: Exemplos de dados gerados usando um ensaio olfativo de quatro campos. (A) Esquema da arena de quatro campos. (B) As respostas neutras são observadas quando todos os quatro quadrantes contêm apenas perfusão de ar seco. (C) Respostas de atração a uma diluição de 6,25% de vinagre de cidra de maçã perfumado do quadrante superior esquerdo. (D) Comportamentos de repulsão desencadeados por 10% de propionato etílico. Na Figura 2B-2D, uma única trajetória dos dados adquiridos é traçada. Um gradiente de cores é usado para significar o curso de tempo de gravação, com as cores azul e vermelha sendo o início e o fim das gravações, respectivamente. (E) Comparação do Índice de Atração (IA) e do Índice percentual (PI). (F) AI média de 3-6 experimentos sem odor (Controle), Vinagre de Cidra de Maçã (ACV) e 10% Propionato de Etila (EP). As barras de erro indicam SEM. A diferença estatística foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de dados gerados pelas etapas de análise de dados. (A) Filtragem espacial dos dados, realizada pela MaskSpatialFiltering.m remover pontos de dados que caem fora da arena. Círculos vermelhos mostram posições iniciais dos círculos que são usados para definir as fronteiras da arena. Os círculos negros são as posições finais, adquiridas montagem dos contornos do círculo nos dados (área sombreada cinza dentro do campo de quatro). Pontos vermelhos e pontas de flecha preta indicam pontos de dados que serão removidos do conjunto de dados após esta etapa de filtragem. (B) Filtragem temporal dos dados, realizada por TemporalFiltering.m. Esta etapa de filtragem remove pontos de dados que se movem muito lentamente ou não, pois eles provavelmente serão gerados por moscas não em movimento ou por sujeira/reflexos da arena. Um ponto vermelho cercado por uma caixa vermelha tracejada indica posições de ~6.000 pontos de dados com coordenadas idênticas que serão removidas por esta etapa de filtragem. (C) Índice de Atração (IA) e Índice percentual (PI), calculado em caixas de 10 segundos ao longo dos últimos 5 minutos de um experimento pelo AttractionIndex.m. Os perfis temporais desses índices contêm informações sobre a dinâmica das respostas comportamentais e podem ser utilizados para análise detalhada dos comportamentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo de código suplementar. Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 18-Jan | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture software | The Imagingsource, NC, USA | (http://www.theimagingsource.com/) | |
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
