דרוזופילה (לא כולל) Y-מבוך Assay: שיטה להערכת תגובות חוש הריח זבובים

Overview

סרטון זה מתאר שיטה לבדיקת התנהגות גישוש חוש הריח בזבוב הפירות, הנקראת מבוך Y. סרטון הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר ולנהל את ההסכמה.

Protocol

טקסט פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Simonnet ואח'., בדיקת Drosophila Olfaction עם Y-מבוך Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. לפני שמתחילים

1. השתמש במלאי ייחוס איזוגני הנושא פנוטיפים התנהגותיים יציבים וחזקים. אין כלל כללי לבחירת מלאי זה, שכן כל הבקרות הפוטנציאליות עשויות לשאת אללים רקע הטרוגניים.
2. השתמש בזן בקרה זה כדי backcross כל מלאי אחר הדרוש לשלבים מאוחרים יותר. צעד גב זה מיוצג בדרך כלל על ידי לפחות 5 צלבים רצופים של נקבה בתולה אחת (כדי לאפשר מעבר אפשרי בין כרומוזומים הומולוגיים) ל 2-3 זכרים התייחסות isogenic. צעד זה חשוב כדי הומוגניזציה הרקע הגנטי בין מניות זבוב שונים.
3. לשמור על מניות דרוזופילה על קמח תירס סטנדרטי (9%), שמרים (10%) משלים עם אנטיביוטיקה (0.4% מתיל פרה הידרוקסי-בנזואט) במחזור אור / כהה 12 שעות ב 25 °C (69 °F).
4. להשיג ניסויים כימוזנסוריים בחדר מבוקר טמפרטורה (25 °C (70 °F) תחת אור אדום רחוק (כדי לחסל את התרומה של רמזים חזותיים, ולהתמקד אותות כימוסנסוריים). לחדש באופן קבוע את האוויר של החדר כדי לאוורר את האזור בין כל ניסוי.

2. תגובת חוש הריח באמצעות Y-מבוך Assay

1. להרעיב את הזבובים במשך 16-18 שעות ב 25 מעלות צלזיוס בצינורות זכוכית המכילים מגבת נייר רטוב לפני הבדיקה.
2. חבר מחבר בצורת Y לשני בקבוקוני זכוכית ולבקבוקון פלסטיק קטן יותר (בקבוקון טעינה). השתמש 1 מיליליטר פיפטה טיפים שעוברים דרך פקק קצף כדי לקשר את המחבר לשלושת בקבוקונים, כדי לקבל מבוך Y אטום היטב. חותכים את הקצוות הצרים של שני קצות פיפטה (קוטר ~ 2 מ"מ, כדי למנוע כל חזרה של הזבוב ברגע שהוא קיבל את החלטתו) כדי ליצור שני בקבוקונים"מלכודת",וקצה גדול של קצה פיפטה אחד כדי ליצור את הצינור "טעינה" ( איור 1A).
3. רגע לפני חיבור בקבוקוניה"מלכודת" (איור 1B),הנח נייר סינון אחד בקוטר ~6 מ"מ בכל בקבוקון. הוסף 40 μl של פתרון ריח על נייר מסנן אחד, ו 40 μl של הממס המתאים על נייר המסנן השני.
4. הצג עשרה זבובים בני 4 עד 9 ימים לתוך בקבוקון ה"טעינה". אין להשתמש בהרדמה CO₂ במהלך העברה זו, שכן יש לה השפעה חזקה על ההתנהגות. במקום להשתמש בקירור קצר על קרח. מניפולציה נכונה של זבובים מורדמת חשוב להגביל את הלחץ על הנושאים ככל האפשר.
   1. בצע סדרה של בדיקות מבוך Y ב 25 °C (תחת אור אדום רחוק (באמצעות נורות LED כדי להגביל את מקור חימום אפשרי) כדי למנוע גירויים חזותיים ככל האפשר. הקפידו להחליף את האוריינטציות של מבוכי Y (ריח המכיל צינור בצד שמאל, או בצד ימין, וצינור טעינה מלפנים או מאחור; איור 1ג).
   2. אפשר כמה שעות עבור זבובים להיכנס בקבוקון המלכודת המכיל את הריח או הממס. Count טסה לאחר 24 שעות כדי להגדיל את ההשתתפות עד יותר מ-80% ולספק את ערך מדד הריח המרבי (Simonnet, תקשורת אישית).
   3. חשב את מדד הריח שנוצר באמצעות הנוסחה הבאה: (מספר בצינור הריח - מספר בצינור הממס)/המספר הכולל של זבובים טעונים.
5. לשטוף Y-מבוך להגדיר כדלקמן: להשרות את ההגדרה המפורקת ב RBS 35 MD לילה. יש לשטוף היטב במי ברז. לבסוף לשטוף עם מים deionized ולתת להתייבש.

3. ניתוח סטטיסטי של הנתונים

1. בצע בדיקת T, ANOVA חד-כיווני או ANOVA דו-כיווני בהתאם לנתונים ומשתנים.

Representative Results

איור 1: תגובת חוש הריח הגברית הוערכה בהגדרת מבוך Y. א) פצל מכשיר. ב) התקן מורכב. ג) הגדרה במצב עבודה תחת אור אדום קיצוני. D) כימות של תגובות חוש הריח הגברי כלפי חומצה אצטית (AA) או חומצה פנילאצטית (PAA) שניהם מדוללים במים מזוקקים (10% v / v) (N = 11, המייצג סך של 110 זבובים). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות בדיקת t המשווה את הנתונים ל- 0. 0 פירושו ללא העדפה. ערך שלילי מצביע על סלידה מהריח, וערך חיובי כאטרקציה. p < 0.0001; ns: לא משמעותי (p = 0.1680). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293