Drosofilia Saggio del labirinto Y: un metodo per valutare le risposte olfattive nelle mosche

Overview

Questo video descrive un metodo per testare il comportamento esplorativo olfattivo nella mosca della frutta, chiamato labirinto Y. La clip del protocollo in primo piano dimostra come impostare e condurre il test.

Protocol

Questo testo del protocollo è un estratto da Simonnet et al.,Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Prima di iniziare

1. Utilizzare uno stock di riferimento isogenizzato con fenotipi comportamentali stabili e robusti. Non esiste una regola generale per la scelta di questo stock, poiché tutti i potenziali controlli possono portare alleli di fondo eterogenei.
2. Utilizzare questo ceppo di controllo per eseguire il backcross di ogni altro stock necessario per i passaggi successivi. Questo passo di backcrossing è tipicamente rappresentato da almeno 5 croci successive di una singola femmina vergine (per consentire un possibile incrocio tra cromosomi omologhi) a 2-3 maschi di riferimento isogenici. Questo passaggio è importante per omogeneizzare il background genetico tra le diverse scorte di mosca.
3. Mantenere le scorte di Drosophila su una farina di mais standard (9%), lievito (10%) e mezzo di agar (1,5%) integrato con antibiotico (0,4% metil para-idrossi-benzoato) in un ciclo chiaro/scuro di 12 ore a 25 °C.
4. Ottenere esperimenti chemosensori in una stanza a temperatura controllata (25 °C) sotto una luce rossa lontana (per eliminare il contributo dei segnali visivi e concentrarsi sui segnali chemosensori). Rinnovare regolarmente l'aria della stanza per ventilare l'area tra ogni esperimento.

2. Risposta olfattiva con un saggio di labirinto Y

1. Affamate le mosche per 16-18 ore a 25 °C in tubi di vetro contenenti tovagliolo di carta bagnato prima del test.
2. Unire un connettore a forma di Y a due flaconcini di vetro e a un flaconcino di plastica più piccolo (flaconcino di carico). Utilizzare punte di pipetta da 1 ml che passano attraverso i tappi di schiuma per collegare il connettore alle tre fiale e per ottenere un labirinto Y ben sigillato. Tagliare le estremità strette di due punte di pipetta (~2 mm di diametro, per evitare qualsiasi ritorno della mosca una volta presa la sua decisione) per formare due flaconcini "trappola" e una grande estremità di una punta di pipetta per formare il tubo di "carico"(Figura 1A).
3. Poco prima di collegare i flaconcini "trappola"(Figura 1B),posizionare una carta filtrante di ~6 mm di diametro in ogni flaconcino. Aggiungere 40 μl di soluzione di odorante su una carta da filtro e 40 μl del solvente corrispondente sulla seconda carta filtrante.
4. Introduci da 4 a 9 mosche di un giorno nel flaconcino "carico". Non usare_{anestesia di} CO 2 durante questo trasferimento, poiché ha un forte effetto sul comportamento. Piuttosto utilizzare un breve raffreddamento sul ghiaccio. Una corretta manipolazione delle mosche anestetizzate è importante per limitare il più possibile lo stress sui soggetti.
   1. Eseguire una serie di test del labirinto Y a 25 °C sotto luce far-red (utilizzando lampadine a LED per limitare possibile la fonte di riscaldamento) per evitare il più possibile gli stimoli visivi. Fare attenzione ad alternare gli orientamenti dei labirinti Y (odorante contenente tubo a sinistra, o a destra, e tubo di carico davanti o nella parte posteriore; Figura 1C).
   2. Lasciare diverse ore affinché le mosche entrino nella fiala trappola contenente l'odorante o il solvente. Count vola dopo 24 ore per aumentare la partecipazione fino a oltre l'80% e fornire il valore massimo dell'indice olfattivo (Simonnet, comunicazione personale).
   3. Calcolare l'indice olfattivo risultante utilizzando la seguente formula: (numero nel tubo degli odori - numero nel tubo del solvente)/numero totale di mosche caricate.
5. Lavare l'insieme del labirinto Y come segue: immergere l'set-up smontato in RBS 35 MD durante la notte. Risciacquare accuratamente con acqua del rubinetto. Infine sciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare.

3. Analisi statistica dei dati

1. Eseguire un test t, un ANOVA uni-way o un ANOVA a due modi a seconda dei dati e delle variabili.

Representative Results

Figura 1: Risposta olfattiva maschile valutata con un set-up di labirinto Y. A) Dispositivo diviso. B) Dispositivo assemblato. C) Sistemazione in condizioni di lavoro a luci farro. D) Quantificazione delle risposte olfattive maschili verso l'acido acetico (AA) o l'acido fenilacetico (PAA) entrambi diluiti in acqua distillata (10% v/v) (N = 11, per un totale di 110 mosche). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t confrontando i dati con 0. 0 significa nessuna preferenza. Un valore negativo indica un'avversione all'odore e un valore positivo un'attrazione. : p < 0,0001; ns: non significativo (p = 0,1680). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293