Drosophila Ensayo de laberinto Y: Un método para evaluar las respuestas olfativas en las moscas

Overview

Este video describe un método para probar el comportamiento exploratorio olfativo en la mosca de la fruta, llamado el laberinto Y. El clip de protocolo destacado muestra cómo configurar y realizar el ensayo.

Protocol

Este texto de protocolo es un extracto de Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Antes de comenzar

1. Utilice un stock de referencia isogenizado que lleve fenotipos conductuales estables y robustos. No existe una regla general para elegir este stock, ya que todos los controles potenciales pueden llevar alelos heterogéneos de fondo.
2. Utilice esta tensión de control para volver a cruzar todos los demás materiales necesarios para pasos posteriores. Este paso de backcrossing está representado típicamente por al menos 5 cruces sucesivos de una sola hembra virgen (para permitir un posible cruce entre cromosomas homólogos) a 2-3 machos de referencia isogénicos. Este paso es importante para homogeneizar el fondo genético entre las diferentes poblaciones de moscas.
3. Mantener las poblaciones de Drosophila en harina de maíz estándar (9%), levadura (10%) y medio agar (1,5%) con antibióticos (0,4% para-hidroxi-benzoato de metilo) en un ciclo claro/oscuro de 12 horas a 25 °C.
4. Lograr experimentos quimiosensoriales en una habitación controlada por temperatura (25 °C) bajo una luz roja extrema (para eliminar la contribución de las señales visuales, y centrarse en las señales quimiosensoriales). Renueve regularmente el aire de la habitación para ventilar el área entre cada experimento.

2. Respuesta olfativa usando un ensayo de laberinto Y

1. Pasa hambre a las moscas durante 16-18 horas a 25 °C en tubos de vidrio que contienen toalla de papel mojado antes de la prueba.
2. Une un conector en forma de Y a dos viales de vidrio y a un vial de plástico más pequeño (vial de carga). Utilice puntas de pipeta de 1 ml que pasen a través de los tapones de espuma para vincular el conector a los tres viales, y para obtener un laberinto Y herméticamente sellado. Cortar los extremos estrechos de dos puntas de pipeta (~ 2 mm de diámetro, para evitar cualquier retorno de la mosca una vez que haya tomado su decisión) para formar dos viales "trampa", y un gran extremo de una punta de pipeta para formar el tubo de "carga" (Figura 1A).
3. Justo antes de conectar los viales de "trampa" (Figura 1B), coloque un papel filtrante de ~ 6 mm de diámetro en cada vial. Añadir 40 μl de solución de odorante en un papel de filtro y 40 μl del disolvente correspondiente en el segundo papel filtrante.
4. Introducir diez moscas de 4 a 9 días de edad en el vial de "carga". No utilice anestesia de CO₂ durante esta transferencia, ya que tiene un fuerte efecto en el comportamiento. Más bien use una refrigeración breve sobre hielo. La manipulación adecuada de las moscas anestesiadas es importante para limitar el estrés en los sujetos tanto como sea posible.
   1. Realice una serie de pruebas de laberinto Y a 25 °C bajo luz roja lejana (utilizando bombillas LED para limitar la posible fuente de calentamiento) para evitar estímulos visuales tanto como sea posible. Tenga cuidado de alternar las orientaciones de los laberintos Y (odorante que contiene tubo a la izquierda, o a la derecha, y tubo de carga delante o en la parte posterior; Figura 1C).
   2. Espere varias horas para que las moscas entren en el vial de trampa que contiene el olor o el disolvente. Count vuela después de las 24 horas para aumentar la participación hasta más del 80% y proporcionar el valor máximo del índice olfativo (Simonnet, comunicación personal).
   3. Calcule el índice olfativo resultante utilizando la siguiente fórmula: (número en el tubo de olor - número en el tubo de disolvente)/número total de moscas cargadas.
5. Lava la configuración de Y-maze de la siguiente manera: remoja la configuración desmantelada en RBS 35 MD durante la noche. Enjuague bien con agua del grifo. Finalmente enjuague con agua desionizada y deje secar.

3. Análisis estadístico de los datos

1. Realice una prueba T, una ANOVA unidireccional o una ANOVA bidireccional en función de los datos y las variables.

Representative Results

Figura 1: Respuesta olfativa masculina evaluada con una configuración de laberinto Y. A) Dispositivo dividido. B) Dispositivo ensamblado. C) Configuración en condiciones de trabajo bajo luz roja lejana. D) Cuantificación de las respuestas olfativas masculinas hacia el ácido acético (AA) o ácido fenillacético (PAA) diluido en agua destilada (10% v/v) (N = 11, que representa un total de 110 moscas). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t comparando los datos con 0. 0 significa que no hay preferencia. Un valor negativo indica una aversión al olor y un valor positivo una atracción. : p < 0.0001; ns: no significativo (p = 0,1680). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293