دروسوفيلا Y-متاهة المقايسة: طريقة لتقييم الاستجابات الشمية في الذباب

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة لاختبار السلوك الاستكشافي الشمي في ذبابة الفاكهة، تسمى متاهة Y. يوضح مقطع البروتوكول المميز كيفية إعداد وإجراء الفحص.

Protocol

هذا النص البروتوكول هو مقتطف من سيمونيت وآخرون., اختبار Drosophila Olfaction مع Y-متاهة المقايسة, J. Vis. Exp. (2014).

1. قبل البدء

1. استخدم مخزون مرجعيا متجانسا يحمل أنماطا ظاهرة سلوكية مستقرة وقوية. لا توجد قاعدة عامة لاختيار هذا المخزون ، لأن جميع الضوابط المحتملة قد تحمل أليلات خلفية غير متجانسة.
2. استخدم سلالة التحكم هذه لتقاطع كل مخزون آخر ضروري للخطوات اللاحقة. وعادة ما يتم تمثيل هذه الخطوة باككروسينج من قبل ما لا يقل عن 5 الصلبان المتعاقبة من أنثى عذراء واحدة (للسماح عبور ممكن بين الكروموسومات متجانسة) إلى 2-3 الذكور المرجعية متساوية المنشأ. هذه الخطوة مهمة لتجانس الخلفية الوراثية بين مخزونات الذباب المختلفة.
3. الحفاظ على مخزونات Drosophila على دقيق الذرة القياسية (9٪)، والخميرة (10٪)، وأغار المتوسطة (1.5٪) تكملها المضادات الحيوية (0.4٪ الميثيل شبه هيدروكسي بنزوات) في دورة ضوء / الظلام 12 ساعة في 25 درجة مئوية.
4. تحقيق التجارب الكيميائية الحسية في غرفة التحكم في درجة الحرارة (25 درجة مئوية) تحت الضوء الأحمر بكثير (للقضاء على مساهمة الإشارات البصرية، والتركيز على الإشارات الكيميائية الحسية). تجديد الهواء بانتظام من الغرفة لتهوية المنطقة بين كل تجربة.

2. استجابة الشم باستخدام Y-متاهة المقايسة

1. تجويع الذباب لمدة 16-18 ساعة في 25 درجة مئوية في أنابيب زجاجية تحتوي على منشفة ورقية مبللة قبل الاختبار.
2. انضم إلى موصل على شكل Y إلى قنينتين زجاجيتين وقارورة بلاستيكية أصغر (قارورة تحميل). استخدام نصائح ماصة 1 مل التي تمر عبر سدادات الرغوة لربط الموصل إلى قوارير الثلاثة، والحصول على مختومة بإحكام Y-المتاهة. قطع النهايات الضيقة من اثنين من نصائح ماصة (~ 2 مم القطر، لتجنب أي عودة الذبابة بمجرد أن اتخذت قرارها) لتشكيل قنينتين "فخ"، ونهاية كبيرة من طرف واحد ماصة لتشكيل أنبوب "تحميل" (الشكل 1A).
3. فقط قبل ربط قارورة "فخ" (الشكل 1B)، ضع ورقة تصفية قطرها ~ 6 مم في كل قارورة. أضف 40 ميكرولتر من محلول الرائحة على ورق فلتر واحد، و40 ميكرولتر من المذيب المقابل على ورق الفلتر الثاني.
4. أدخل عشر ذبابات عمرها 4 إلى 9 أيام في قارورة "التحميل". لا تستخدم CO_{2 التخدير} أثناء هذا النقل، لأنه له تأثير قوي على السلوك. بدلا من استخدام التبريد وجيزة على الجليد. من المهم التلاعب السليم بالذباب المخدر للحد من الضغط على الموضوعات قدر الإمكان.
   1. قم بإجراء سلسلة من اختبارات Y-maze عند 25 درجة مئوية تحت ضوء أحمر بعيد (باستخدام مصابيح LED للحد من مصدر التدفئة المحتمل) لتجنب المحفزات البصرية قدر الإمكان. كن حذرا لتناوب التوجهات من متاهات Y (الرائحة التي تحتوي على أنبوب على اليسار، أو على اليمين، وتحميل أنبوب في الجبهة أو في الخلف؛ الشكل 1جيم).
   2. السماح لعدة ساعات للذباب للدخول في قارورة فخ تحتوي على الرائحة أو المذيبات. عد الذباب بعد 24 ساعة لزيادة المشاركة تصل إلى أكثر من 80٪ وتوفير الحد الأقصى لقيمة مؤشر الشم (سيمونيت، الاتصالات الشخصية).
   3. احسب مؤشر الشم الناتج باستخدام الصيغة التالية: (رقم في أنبوب الرائحة - رقم في أنبوب المذيبات) / العدد الإجمالي للذباب المحمل.
5. غسل Y-متاهة انشاء على النحو التالي: نقع مجموعة تفكيكها في RBS 35 MD بين عشية وضحاها. شطف جيدا مع ماء الصنبور. أخيرا شطف مع الماء deionized والسماح لتجف.

3. التحليل الإحصائي للبيانات

1. إجراء t-test أو ANOVA أحادي الاتجاه أو ANOVA ثنائي الاتجاه اعتمادا على البيانات والمتغيرات.

Representative Results

الشكل 1: تقييم استجابة الشم الذكوري بإعداد متاهة Y. أ) تقسيم الجهاز. ب) الجهاز المجمع. ج) الإعداد في حالة العمل تحت الضوء الأحمر البعيد. D) القياس الكمي للاستجابات الشمية الذكور نحو حمض الخليك (AA) أو حمض الفينيلليستيك (PAA) على حد سواء المخفف في الماء المقطر (10٪ v/v) (N = 11، وهو ما يمثل ما مجموعه 110 الذباب). وقد تم إجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار t يقارن البيانات ب 0. 0 يعني عدم وجود تفضيل. تشير القيمة السالبة إلى النفور من الرائحة، وقيمة إيجابية عامل جذب. p < 0.0001; ns: غير هام (p = 0.1680). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293