ड्रोसोफिला Y-भूलभुलैया परख: मक्खियों में घ्राण प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो फल मक्खी में घ्राण अन्वेषणात्मक व्यवहार का परीक्षण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जिसे वाई-भूलभुलैया कहा जाता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल क्लिप कैसे स्थापित करने के लिए और परख आचरण को दर्शाता है ।

Protocol

यह प्रोटोकॉल पाठ सिमोननेट एट अलसे एक अंश है, एक वाई-भूलभुलैया परख, जे विस Expके साथ ड्रोसोफिला ओल्फैक्शन का परीक्षण। (2014).

1. शुरू करने से पहले

1. स्थिर और मजबूत व्यवहार फेनोटाइप वाले आइसोजेनाइज्ड संदर्भ स्टॉक का उपयोग करें। इस स्टॉक को चुनने के लिए कोई सामान्य नियम नहीं है, क्योंकि सभी संभावित नियंत्रण विषम पृष्ठभूमि एलील्स ले सकते हैं।
2. बाद के चरणों के लिए आवश्यक हर दूसरे स्टॉक को बैकक्रॉस करने के लिए इस नियंत्रण तनाव का उपयोग करें। इस बैकक्रॉसिंग चरण को आम तौर पर एक कुंवारी महिला के कम से कम 5 लगातार क्रॉस द्वारा दर्शाया जाता है (2-3 आइसोजेनिक संदर्भ पुरुषों के मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच संभावित क्रॉसिंग-ओवर की अनुमति देने के लिए) । यह कदम विभिन्न फ्लाई स्टॉक के बीच आनुवंशिक पृष्ठभूमि को समरूप बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
3. एक मानक मकई के आटे (9%), खमीर (10%), और आगर माध्यम (१.५%) 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र में एंटीबायोटिक (0.4% मिथाइल पैरा-हाइड्रोक्सी-बेंजोएट) के साथ पूरित।
4. सुदूर लाल प्रकाश के तहत तापमान-नियंत्रित कमरे (25 डिग्री सेल्सियस) में केमोसेंसरी प्रयोगों को प्राप्त करें (दृश्य संकेतों के योगदान को खत्म करने के लिए, और रसायनसेंसरी संकेतों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए)। प्रत्येक प्रयोग के बीच क्षेत्र को हवादार करने के लिए नियमित रूप से कमरे की हवा को नवीनीकृत करें।

2. एक वाई-भूलभुलैया परख का उपयोग कर घ्राण प्रतिक्रिया

1. परीक्षण से पहले गीले कागज तौलिया युक्त कांच की ट्यूबों में 25 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए मक्खियों को भूखा रखें।
2. दो ग्लास शीशियों के लिए और एक छोटे प्लास्टिक शीशी (लोडिंग शीशी) के लिए एक वाई आकार कनेक्टर में शामिल हों । कनेक्टर को तीन शीशियों से जोड़ने के लिए फोम स्टॉपर्स से गुजरने वाले 1 मिलीलीटर पिपेट युक्तियों का उपयोग करें, और एक कसकर सील किए गए वाई-भूलभुलैया प्राप्त करने के लिए। दो पिपेट युक्तियों (~ 2 मिमी व्यास) के संकीर्ण सिरों को काटें, एक बार अपना निर्णय लेने के बाद फ्लाई की किसी भी वापसी से बचने के लिए) दो "जाल" शीशियों को बनाने के लिए, और "लोडिंग" ट्यूब(चित्रा 1ए)बनाने के लिए एक पिपेट टिप का एक बड़ा अंत।
3. "जाल" शीशियों(चित्रा 1बी)को जोड़ने से ठीक पहले, प्रत्येक शीशी में एक ~ 6 मिमी व्यास फिल्टर पेपर रखें। एक फिल्टर पेपर पर 40 μl गंध समाधान जोड़ें, और दूसरे फिल्टर पेपर पर संबंधित सॉल्वेंट के 40 माइक्रोन जोड़ें।
4. "लोडिंग" शीशी में दस 4 से 9 दिन पुरानी मक्खियों का परिचय दें। इस स्थानांतरण के दौरान सीओ₂ संज्ञाहरण का उपयोग न करें, क्योंकि इसका व्यवहार पर मजबूत प्रभाव पड़ता है। बल्कि बर्फ पर संक्षिप्त ठंडा का उपयोग करें। जितना संभव हो विषयों पर तनाव को सीमित करने के लिए एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों का उचित हेरफेर महत्वपूर्ण है।
   1. जितना संभव हो दृश्य उत्तेजनाओं से बचने के लिए सुदूर-लाल बत्ती (संभावित हीटिंग स्रोत को सीमित करने के लिए एलईडी बल्ब का उपयोग करके) के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर वाई-भूलभुलैया परीक्षणों की एक श्रृंखला करें। वाई-भूलभुलैया (गंध युक्त ट्यूब बाईं ओर, या दाईं ओर, और सामने या पीठ में ट्यूब लोड करने के लिए वैकल्पिक करने के लिए सावधान रहें; चित्रा 1C)।
   2. मक्खियों को गंध या विलायक युक्त जाल शीशी में प्रवेश करने के लिए कई घंटे की अनुमति दें। गिनती 80% से अधिक तक भागीदारी बढ़ाने के लिए 24 घंटे के बाद मक्खियों और अधिकतम घ्राण सूचकांक मूल्य (सिमोनेट, व्यक्तिगत संचार) प्रदान करते हैं।
   3. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके परिणामस्वरूप घ्राण सूचकांक की गणना करें: (गंध ट्यूब में संख्या - सॉल्वेंट ट्यूब में संख्या)/लोडेड मक्खियों की कुल संख्या।
5. धोने Y-भूलभुलैया सेट अप के रूप में इस प्रकार है: ध्वस्त सेट अप आरबीएस ३५ एमडी में रातोंरात सोख । नल के पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें। अंत में डियोनाइज्ड पानी से कुल्ला करें और सूखने दें।

3. डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण

1. डेटा और चर के आधार पर एक टी-टेस्ट, एक तरह से ANOVA या दो तरह से ANOVA प्रदर्शन करें।

Representative Results

चित्रा 1: पुरुष घ्राण प्रतिक्रिया एक Y-भूलभुलैया सेट अप के साथ मूल्यांकन किया । ए) स्प्लिट डिवाइस। ख) इकट्ठे डिवाइस । ग) सुदूर-लाल बत्ती के तहत कार्य दशा में सेट-अप । घ) एसिटिक एसिड (एए) या फेनिलेस्टिक एसिड (पीएए) की ओर पुरुष घ्राण प्रतिक्रियाओं का मात्राकरण दोनों आसुत पानी (10% v/v) (एन = 11, कुल ११० मक्खियों का प्रतिनिधित्व करते हैं) में पतला । सांख्यिकीय विश्लेषण 0 से डेटा की तुलना में एक टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था । 0 मतलब कोई वरीयता नहीं। एक नकारात्मक मूल्य गंध के लिए एक घृणा इंगित करता है, और एक सकारात्मक मूल्य एक आकर्षण । : पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001; एनएस: गैर महत्वपूर्ण (पी = 0.1680) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293