Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Drosophila Y-maze Assay: En metode for å vurdere olfaktoriske svar i fluer

Overview

Denne videoen beskriver en metode for å teste olfaktorisk utforskende oppførsel i fruktfluen, kalt Y-labyrinten. Det utvalgte protokollklippet viser hvordan du konfigurerer og utfører analysen.

Protocol

Denne protokollteksten er et utdrag fra Simonnet et al.,Testing Drosophila Olfaction med en Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Før du starter

  1. Bruk en isogenisert referanselager med stabile og robuste atferdsfenotyper. Det er ingen generell regel for å velge denne aksjen, siden alle potensielle kontroller kan bære heterogene bakgrunnsgater.
  2. Bruk denne kontrollstammen til å tilbakese annenhver lager som er nødvendig for senere trinn. Dette backcrossing trinnet er vanligvis representert av minst 5 påfølgende kryss av en enkelt jomfru kvinne (for å tillate mulig kryssing mellom homologe kromosomer) til 2-3 isogene referansehanner. Dette trinnet er viktig for å homogenisere den genetiske bakgrunnen mellom de forskjellige fluebestandene.
  3. Vedlikehold Drosophila-lagre på et standard maismel (9%), gjær (10%), og agar medium (1,5%) supplert med antibiotika (0,4 % metylparahydroksy-benzoat) i en 12-timers lys/mørk syklus ved 25 °C.
  4. Oppnå kjemosensoriske eksperimenter i et temperaturkontrollert rom (25 °C) under langt rødt lys (for å eliminere bidraget fra visuelle signaler, og for å fokusere på kjemosensoriske signaler). Forny regelmessig luften i rommet for å ventilere området mellom hvert eksperiment.

2. Olfaktorisk respons ved hjelp av en Y-labyrintanalyse

  1. Sult fluene i 16-18 timer ved 25 °C i glassrør som inneholder vått papirhåndkle før testing.
  2. Koble en Y-form kobling til to hetteglass i glass og til et mindre hetteglass av plast (hetteglass med lasting). Bruk 1 ml pipettespisser som passerer gjennom skumproppene for å koble kontakten til de tre hetteglassene, og for å få en tett forseglet Y-labyrint. Klipp de smale endene av to pipettespisser (~ 2 mm diameter, for å unngå retur av flyet når det har tatt sin beslutning) å danne to "felle" hetteglass, og en stor ende av en pipettespiss for å danne "lasting" -røret (Figur 1A).
  3. Like før du kobler til hetteglassene med "felle" (figur 1B), plasserer du ett filterpapir med diameter ~6 mm i hvert hetteglass. Tilsett 40 μl luktvæskeoppløsning på ett filterpapir, og 40 μl av det tilsvarende løsningsmidlet på det andre filterpapiret.
  4. Introduser ti 4 til 9 dag gamle fluer i hetteglasset "lasting". Ikke bruk CO2 anestesi under denne overføringen, siden det har en sterk effekt på atferd. Bruk heller kort kjøling på is. Riktig manipulering av bedøvede fluer er viktig for å begrense stress på fagene så mye som mulig.
    1. Utfør en serie Y-labyrint tester ved 25 °C under fjernt rødt lys (ved hjelp av LED-pærer for å begrense mulig varmekilde) for å unngå visuelle stimuli så mye som mulig. Pass på å skifte orienteringene til Y-labyrintene (luktstoff som inneholder rør til venstre, eller til høyre, og lasterør foran eller bak; Figur 1C).
    2. La det gå flere timer før fluene kommer inn i felle hetteglasset som inneholder luktstoffet eller løsningsmidlet. Count flyr etter 24 timer for å øke deltakelsen opp til mer enn 80% og gi maksimal olfaktorisk indeksverdi (Simonnet, personlig kommunikasjon).
    3. Beregn den resulterende olfaktoriske indeksen ved hjelp av følgende formel: (nummer i luktrøret - nummer i løsningsmiddelrøret)/totalt antall lastede fluer.
  5. Vask Y-labyrintoppsettet på følgende måte: Bløtlegg det demonterte oppsettet i RBS 35 MD over natten. Skyll grundig med vann fra springen. Skyll til slutt med deionisert vann og la det tørke ut.

3. Statistisk analyse av dataene

  1. Utfør en t-test, en enveis ANOVA eller en toveis ANOVA avhengig av data og variabler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Mannlig olfaktorisk respons vurdert med et Y-labyrintoppsett. A) Delt enhet. B) Montert enhet. C) Oppsett i arbeidstilstand under fjernt rødt lys. D) Kvantifisering av mannlige olfaktoriske responser mot eddiksyre (AA) eller fenylacetic acid (PAA) begge fortynnet i destillert vann (10% v / v) (N = 11, som representerer totalt 110 fluer). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en t-test som sammenlignet dataene med 0. 0 betyr ingen preferanse. En negativ verdi indikerer en aversjon mot luktstoffet, og en positiv verdi en attraksjon. : p < 0,0001; ns: ikke signifikant (p = 0,1680). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Polystyrene tube VWR europe 734-2255 30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube Dijon verre 95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper Dutscher 999038 Y-maze
Y-shaped connector Europrix 11020605 Y-maze
100-1,000 µl pipette tips Corning 4868 Join the following pipette tips to the Y-shaped connector.
Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials.
These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors.
Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb Rubin-Lacaque 0RB180238 625-630 nm
Acetic Acid Sigma-Aldrich 45725
Phenylacetic Acid Sigma-Aldrich P16621
Yeast Sensient Flavors Strasbourg 1018880464
Cornmeal eurogerm Farine de maïs
Agar Kalys HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate VWR international 25605293

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tom verdi Problem
<em>Drosophila</em> Y-maze Assay: En metode for å vurdere olfaktoriske svar i fluer
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Kilde: Simonnet, M.M., et al. Testing Drosophila Olfaction med en Y-labyrint Assay. J. Vis. Utt. (2014).

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter