Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

Overview

Deze video beschrijft hoe u micro-invoegingen uitvoert die reagentia leveren in levende Drosophila-embryo's. Onderzoekers kunnen deze methode gebruiken om exogene verbindingen zoals nucleïnezuren en eiwitten te introduceren tijdens de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Het aanbevolen protocol demonstreert hoe de procedure voor injectie van een oplosbaar reagens moet worden opgezet en uitgevoerd - hier een fluorescerend eiwit voor live beeldvormingsexperimenten.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Brust-Mascher en Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).

Recepten:

Grape Juice borden:

• 5.5g bacto agar

• 14,5 g dextrose of glucose

• 7,15 g sacharose

• 45 ml druivensapconcentraat (100% sap).

• 204,5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

Meng alle ingrediënten en magnetron tot het kookt.
Voeg 2,8 ml zuurmix toe (zuurmix: 20,9 ml propionzuur, 2,1 ml fosforzuur, 27 ml H₂0)

Meng en giet op 35 mm Petrischaaltjes. Laat een of twee dagen stollen bij kamertemperatuur. Als platen niet snel worden gebruikt, verzegel dan met parafilm en houd ze op 4 °C (laat voor gebruik gelijk aan RT staan).

Gistpasta:
Los ongeveer een theelepel gist (Sigma YSC2, gist van Saccharomyces cerevisiae type II) op in water om een dikke pasta te vormen. Leg een kleine hoeveelheid hiervan op elke druivensapplaat vlak voor gebruik.

Injectiebuffer:

• 150 mM K-Aspartaat

• 10 mM K-fosfaat

• 20 mM imidazol, pH 7,2

Heptaanlijm:
Rol dubbele plakband uit en plaats in een fles van 100 ml, voeg ongeveer 50 ml heptaan toe, sluit de fles af en rock gedurende meerdere dagen. Voeg bij gebruik heptaan toe als de lijm te dik is.

Uitdrogingskamer:
Neem een petrischaal van 100 mm, doe een deel van een schaal van 35 mm erin om een "tafel" te maken en voeg er Drieriet (watervrij calciumsulfaat) omheen, zodat de hoogte van Drieriet niet hoger is dan de "tafel" en dek af. De coverslip met embryo's wordt op deze "tafel" geplaatst voor uitdroging vóór injectie. Het is een goed idee om op zijn minst wat aan te geven Drierite te gebruiken en het te wijzigen wanneer het van kleur is veranderd.

Protocol:
Dit protocol kan worden gebruikt voor injectie van vrijwel elk oplosbaar reagens in het Syncytiële Embryo drosophila: bijvoorbeeld een fluorescerend eiwit voor observatie of een doeleiwitremmer of beide.

1. Embryo's verzamelen

1. Leg een nieuwe druivensapplaat op de legkooi.
2. Verwijder deze plaat na een uur, dit is de eerste verzameling van de dag en is vaak niet erg goed. Het kan worden weggegooid.
3. Verwissel de plaat elk uur om embryo's elk een uur te blijven verzamelen.

2. Coverslip voorbereiding

1. Leg een 50 x 22mm coverslip aan één kant van een microscoopschuif. Plak de vier hoeken op de dia zodat deze niet beweegt.
2. Doe met behulp van een applicator met katoenen punt een laag heptaanlijm in één lijn op de afdeklip (de lijm mag niet stroperig zijn en moet binnen een paar seconden drogen, anders meer heptaan toevoegen).
3. Leg een stuk dubbele plakband op de glijbaan naar de zijkant van de coverslip.

3. Embryovoorbereiding

OPMERKING: Embryo's moeten ongeveer 2 uur na het begin van de verzameling worden afgebeeld, dus begin met de volgende stappen, zodat er voldoende tijd is om ze binnen dit tijdsbestek af te ronden.

1. Pak met een bevochtigde borstel de embryo's voorzichtig van de druivensapplaat en leg ze op dubbele plakband op de glijbaan.
2. Rol de embryo's met behulp van het buitenste deel van het pincet over de dubbele plakband totdat het koraal (het buitenste membraan) openbreekt.
3. Pak het embryo op door het voorzichtig over het koraal te rollen, zodat het aan het pincet blijft plakken en plaats het op de heptaanlijm op de coverslip met de lange kant van het embryo evenwijdig aan de lange kant van de coverslip. Zet 10 tot 20 embryo's op één rij.
4. Verwijder de afdeklip en plaats deze gedurende 3 tot 8 minuten in de uitdrogingskamer (dit is afhankelijk van de vochtigheid van de kamer en de hoeveelheid die moet worden geïnjecteerd).
5. Plaats op een metalen kamer met vacuümvet.
6. Bedek de embryo's met halocarbonolie 700 om verdere uitdroging te voorkomen. Embryo's zijn nu klaar voor injectie.

4. Embryo-injectie

1. Vind de embryo's onder een 16x objectief.
2. Verplaats de embryo's weg en vind de naald zonder het brandpuntsvlak te bewegen.
3. Centreer de naald en beweeg deze omhoog zonder deze in x- of y-richting te bewegen.
4. Als de naald niet open is, plaatst u de rand van de afdeklip in het gezichtsveld, maar niet waar de naald zich bevindt, en laat u de naald op hetzelfde brandpuntsvlak zakken. Beweeg de afdeklip zeer voorzichtig totdat deze de naald raakt en voorzichtig openbreekt. Als de naald open is, gaat u naar stap 5. (Naalden kunnen worden geopend met fluorwaterstofzuur voor het vullen).
5. Zet de embryo's in het zicht (maar niet waar de naald zal zijn), laat de naald in de olie zakken en zorg ervoor dat je mooie vloeibare druppels uit de naald haalt.
6. Beweeg het embryo voorzichtig maar gestaag in de naald en injecteer een druppel in het embryo en verplaats het embryo weg. (Of volg de instructies van uw injectieapparaat).
7. Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, zijn ze klaar voor observatie op een confocale microscoop.