Mikroinjektion von lebenden Drosophila-Embryonen: Frühe Lieferung von Reagenzien an den sich entwickelnden Embryo

Overview

Dieses Video beschreibt, wie Mikroinjektionen durchgeführt werden, die Reagenzien in lebende Drosophila-Embryonen liefern. Forscher können diese Methode verwenden, um exogene Verbindungen wie Nukleinsäuren und Proteine in den frühen Stadien der Embryoentwicklung einzuführen. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie das Injektionsverfahren für ein lösliches Reagenz eingerichtet und durchgeführt wird – hier ein fluoreszierendes Protein für Live-Bildgebungsexperimente.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Brust-Mascher und Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).

Rezepte:

Traubensaftteller:

• 5.5g Bacto Agar

• 14,5 g Dextrose oder Glukose

• 7,15 g Saccharose

• 45 ml Traubensaftkonzentrat (100% Saft).

• 204,5 ml H₂0

• 625 l 10N NaOH

Mischen Sie alle Zutaten und Mikrowelle bis zum Kochen.
2,8 ml Säuremischung hinzufügen (Säuremischung: 20,9 ml Propionsäure, 2,1 ml Phosphorsäure, 27 ml H₂0)

Mischen und auf 35 mm Petrischalen gießen. Lassen Sie bei Raumtemperatur für ein oder zwei Tage erstarren. Wenn Platten nicht bald verwendet werden, mit Parafilm versiegeln und bei 4 °C halten (erlauben, vor der Verwendung mit RT auszuwerten).

Hefepaste:
Lösen Sie etwa einen Teelöffel Hefe (Sigma YSC2, Hefe aus Saccharomyces cerevisiae Typ II) in Wasser, um eine dicke Paste zu bilden. Legen Sie eine kleine Menge davon auf jede Traubensaftplatte kurz vor der Verwendung.

Injektionspuffer:

• 150 mM K-Aspartat

• 10 mM K-Phosphat

• 20 mM Imidazol, pH 7,2

Heptankleber:
Doppelklebeband ausrollen und in eine 100ml Flasche geben, ca. 50ml Heptan hinzufügen, die Flasche versiegeln und mehrere Tage rocken. Bei der Verwendung Heptan hinzufügen, wenn der Kleber zu dick ist.

Entwässerungskammer:
Nehmen Sie eine 100 mm Petrischale, legen Sie einen Teil einer 35 mm Schale innen, um einen "Tisch" zu machen und fügen Sie Drierite (wasserfreies Calciumsulfat) um sie herum, so dass die Höhe von Drierite nicht höher als die "Tabelle" und Abdeckung ist. Der Deckschein mit Embryonen wird auf diesem "Tisch" zur Dehydrierung vor der Injektion platziert. Es ist eine gute Idee, zumindest einige, die Drierite anzeigen, zu verwenden und es zu ändern, wenn es die Farbe geändert hat.

Protokoll:
Dieses Protokoll kann zur Injektion praktisch jedes löslichen Reagenzes in den Drosophila-Synzytial-Embryo verwendet werden: zum Beispiel entweder ein fluoreszierendes Protein zur Beobachtung oder ein Zielproteinhemmer oder beides.

1. Embryo-Sammlung

1. Legen Sie einen neuen Traubensaftteller auf den Laienkäfig.
2. Entfernen Sie diese Platte nach einer Stunde, dies ist die erste Sammlung des Tages und ist oft nicht sehr gut. Es kann verworfen werden.
3. Wechseln Sie die Platte stündlich, um Embryonen für jeweils eine Stunde zu sammeln.

2. Coverslip-Vorbereitung

1. Legen Sie einen 50 x 22mm Coverslip auf eine Seite eines Mikroskopschlittens. Kleben Sie die vier Ecken auf die Folie, damit sie sich nicht bewegt.
2. Mit einem Baumwolle gekippt Applikator, legen Sie eine Schicht Heptan Kleber in einer Linie auf dem Deckel (der Kleber sollte nicht zähflüssig und sollte in ein paar Sekunden trocknen, sonst fügen Sie mehr Heptan).
3. Legen Sie ein Stück Doppelklebeband auf die Folie zur Seite des Coverslip.

3. Embryonenzubereitung

HINWEIS: Embryonen sollten etwa 2 Stunden nach Beginn der Sammlung abgebildet werden, also beginnen Sie die folgenden Schritte, so dass genügend Zeit, um sie innerhalb dieses Zeitrahmens zu beenden.

1. Mit einer befeuchteten Bürste die Embryonen vorsichtig vom Traubensaftteller aufnehmen und auf doppeltes Klebeband auf schieben.
2. Mit dem äußeren Teil der Pinzette rollen Sie die Embryonen über das doppelte Klebeband, bis die Chorion (die äußere Membran) aufbricht.
3. Nehmen Sie den Embryo auf, indem Sie ihn sanft über den Chorion rollen, so dass er an der Pinzette klebt, und ihn auf den Heptankleber auf dem Deckelzettel legen, wobei die lange Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Coverslips verläuft. Richten Sie 10 bis 20 Embryonen in einer Reihe ein.
4. Entfernen Sie den Deckelund legen Sie ihn 3 bis 8 Minuten in die Austrocknungskammer (dies hängt von der Feuchtigkeit des Raumes und der zu injizierenden Menge ab).
5. Auf eine Metallkammer mit Vakuumfett legen.
6. Bedecken Sie die Embryonen mit Halocarbonöl 700, um weitere Austrocknung zu vermeiden. Embryonen sind nun zur Injektion bereit.

4. Embryo-Injektion

1. Finden Sie die Embryonen unter einem 16-fachen Objektiv.
2. Bewegen Sie die Embryonen weg, und finden Sie die Nadel, ohne die Brennebene zu bewegen.
3. Zentrieren Sie die Nadel und bewegen Sie sie nach oben, ohne sie in x- oder y-Richtung zu bewegen.
4. Wenn die Nadel nicht geöffnet ist, legen Sie die Kante des Deckels in das Sichtfeld, aber nicht, wo die Nadel sein wird, und senken Sie die Nadel auf die gleiche Brennebene. Bewegen Sie den Coverslip sehr vorsichtig, bis er auf die Nadel trifft und sie sanft aufbricht. Wenn die Nadel geöffnet ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort. (Nadeln können vor dem Füllen mit Flusssäure geöffnet werden).
5. Setzen Sie die Embryonen in Sicht (aber nicht, wo die Nadel sein wird), senken Sie die Nadel in das Öl und stellen Sie sicher, dass Sie schöne flüssige Tropfen von der Nadel erhalten.
6. Bewegen Sie den Embryo vorsichtig, aber stetig in die Nadel und injizieren Sie einen Tropfen in den Embryo und bewegen Sie den Embryo weg. (Oder folgen Sie den Anweisungen Ihres Injektionsgeräts).
7. Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, sind sie bereit für die Beobachtung auf einem konfokalen Mikroskop.