लाइव ड्रोसोफिला भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन: विकासशील भ्रूण को रीएजेंट्स की जल्दी डिलीवरी

Overview

इस वीडियो में बताया गया है कि लाइव ड्रोसोफिला भ्रूण में रिएजेंट्स देने वाले माइक्रोइंजेक्शन कैसे करें । शोधकर्ता इस विधि का उपयोग भ्रूण के विकास के शुरुआती दौर के दौरान न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन जैसे बहिर्जात यौगिकों को पेश करने के लिए कर सकते हैं । विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि किसी भी घुलनशील अभिकर्षक के इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया को कैसे स्थापित किया जाए और कैसे किया जाए- यहां, लाइव इमेजिंग प्रयोगों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन।

Protocol

यह प्रोटोकॉल ब्रुस्ट-माचर और शोले, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर सिंक्टियलभ्रूण, जे विस एक्सपीमें मिटोसिस का अध्ययन करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों का एक अंश है। (2009).

व्यंजनों:

अंगूर का रस प्लेटें:

• 5.5 ग्राम बैक्टो एगर

• 14.5 ग्राम डेक्सट्रोस या ग्लूकोज

• 7.15 ग्राम सुक्रोज

• 45 मिली अंगूर का रस ध्यान केंद्रित (100% रस)।

• 204.5 मिलीलीटर एच₂0

• 625 माइक्रोन 10N NaOH

उबलने तक सभी सामग्री और माइक्रोवेव मिलाएं।
2.8 मिलीलीटर एसिड मिश्रण जोड़ें (एसिड मिश्रण: 20.9 मिलीलीटर प्रोपियोनिक एसिड, 2.1 मिलीलीटर फॉस्फोरिक एसिड, 27 मिलीलीटर एच₂0)

मिक्स और 35 मिमी पेट्री व्यंजन पर डालना। एक या दो दिनों के लिए कमरे के तापमान पर जमना करते हैं। यदि प्लेटों का जल्द ही उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो पैराफिल्म के साथ सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (उपयोग करने से पहले आरटी को बराबर करने की अनुमति दें)।

खमीर पेस्ट:
एक मोटी पेस्ट बनाने के लिए पानी में लगभग एक चम्मच खमीर (सिग्मा वाईएससी 2, सैकरोमाइसेस सेरेविसिया प्रकार II से खमीर) को भंग करें। उपयोग करने से ठीक पहले प्रत्येक अंगूर के रस की प्लेट पर इसकी एक छोटी राशि रखें।

इंजेक्शन बफर:

• 150 एमएल के-एस्पार्टेट

• 10 mM K-फॉस्फेट

• 20 m imidazole, पीएच 7.2

हेप्टेन गोंद:
डबल चिपचिपा टेप खोलें और 100 मिलीलीटर की बोतल में रखें, लगभग 50 मिलीलीटर हेप्टेन जोड़ें, बोतल को सील करें, और कई दिनों तक रॉक करें। उपयोग करते समय, यदि गोंद बहुत मोटा है तो हेप्टेन जोड़ें।

निर्जलीकरण कक्ष:
एक 100 मिमी पेट्री डिश लें, "टेबल" बनाने के लिए 35 मिमी डिश का एक हिस्सा अंदर रखें और इसके चारों ओर ड्राइराइट (निर्जल कैल्शियम सल्फेट) जोड़ें ताकि ड्राइराइट की ऊंचाई "टेबल" और कवर से अधिक न हो। भ्रूण के साथ कवरलिप इंजेक्शन से पहले निर्जलीकरण के लिए इस "मेज" पर रखा जाएगा । कम से कम कुछ संकेत ड्रिराइट का उपयोग करना और रंग बदलने पर इसे बदलना एक अच्छा विचार है।

प्रोटोकॉल:
इस प्रोटोकॉल का उपयोग ड्रोसोफिला सिंक्टियल भ्रूण में लगभग किसी भी घुलनशील अभिवास्तु के इंजेक्शन के लिए किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, या तो अवलोकन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन या एक लक्ष्य प्रोटीन अवरोधक या दोनों।

1. भ्रूण संग्रह

1. वट पिंजरे पर एक नया अंगूर का रस प्लेट रखो।
2. एक घंटे के बाद इस थाली को हटा दें, यह दिन का पहला संग्रह है और अक्सर बहुत अच्छा नहीं होता है। इसे छोड़ दिया जा सकता है।
3. एक घंटे के लिए भ्रूण इकट्ठा रखने के लिए हर घंटे थाली बदलें ।

2. कवरस्लिप तैयारी

1. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के एक तरफ एक 50 x 22mm कवरलिप रखो। स्लाइड करने के लिए चार कोनों टेप तो यह कदम नहीं है ।
2. एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग करना, कवरस्लिप पर एक पंक्ति में हेप्टेन गोंद की एक परत डाल (गोंद चिपचिपा नहीं होना चाहिए और कुछ सेकंड में सूख जाना चाहिए, अन्यथा अधिक हेप्टेन जोड़ें)।
3. कवरस्लिप के पक्ष की ओर स्लाइड पर डबल चिपचिपा टेप का एक टुकड़ा रखो।

3. भ्रूण की तैयारी

नोट: भ्रूण संग्रह की शुरुआत के बाद 2 घंटे के बारे में छवि होनी चाहिए, तो पर्याप्त समय के लिए उंहें इस समय सीमा के भीतर खत्म करने की अनुमति निम्नलिखित कदम शुरू करते हैं ।

1. एक गीला ब्रश के साथ ध्यान से अंगूर का रस थाली से भ्रूण लेने और स्लाइड पर डबल चिपचिपा टेप पर जगह है ।
2. चिमटी के बाहरी हिस्से का उपयोग करना, डबल चिपचिपा टेप पर भ्रूण रोल जब तक chorion (बाहरी झिल्ली) खुला टूट जाता है ।
3. धीरे से यह chorion पर रोलिंग द्वारा भ्रूण उठाओ तो यह चिमटी से चिपक जाती है और यह कवरस्लिप के लंबे पक्ष के समानांतर भ्रूण के लंबे पक्ष के साथ कवरस्लिप पर हेप्टेन गोंद पर जगह है । एक पंक्ति में 10 से 20 भ्रूण स्थापित करें।
4. कवरलिप निकालें और इसे 3 से 8 मिनट के लिए निर्जलीकरण कक्ष में रखें (यह कमरे की आर्द्रता और इंजेक्शन की जाने वाली राशि पर निर्भर करता है)।
5. वैक्यूम तेल के साथ एक धातु कक्ष पर रखें।
6. आगे निर्जलीकरण से बचने के लिए हेलोकार्बन तेल 700 के साथ भ्रूण को कवर करें। भ्रूण अब इंजेक्शन के लिए तैयार हैं।

4. भ्रूण इंजेक्शन

1. एक 16x उद्देश्य के तहत भ्रूण का पता लगाएं।
2. भ्रूण दूर ले जाएँ, और फोकल विमान चलती बिना सुई लगता है।
3. सुई को केंद्र में रखें और इसे एक्स या वाई दिशा में ले जाने के बिना इसे ऊपर ले जाएं।
4. यदि सुई खुली नहीं है, तो कवरस्लिप के किनारे को देखने के क्षेत्र में रखें, लेकिन जहां सुई होगी, वहां नहीं, और सुई को उसी फोकल प्लेन में कम करें। बहुत ध्यान से कवर्लिप को तब तक ले जाएं जब तक कि यह सुई से टकराता है और धीरे-धीरे इसे खोलता है। अगर सुई खुली है तो स्टेप 5 पर जाएं। (सुई भरने से पहले हाइड्रोफ्लोरिक एसिड के साथ खोला जा सकता है)।
5. भ्रूण को ध्यान में रखें (लेकिन सुई कहां नहीं होगी), सुई को तेल में कम करें और सुनिश्चित करें कि आप सुई से अच्छी तरल बूंदें प्राप्त करें।
6. ध्यान से लेकिन तेजी से सुई में भ्रूण ले जाएँ और भ्रूण में एक बूंद सुई और भ्रूण दूर ले जाते हैं। (या अपने इंजेक्शन तंत्र के निर्देशों का पालन करें)।
7. सभी भ्रूण इंजेक्शन के बाद, वे एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर अवलोकन के लिए तैयार हैं।