살아있는 drosophila 태아의 미세 주입: 개발 태아에 시약의 조기 납품

Overview

이 비디오는 살아있는 Drosophila 배아로 시약을 전달하는 미세 주입을 수행하는 방법을 설명합니다. 연구원은 배아 발달의 초기 단계 도중 핵산 및 단백질 같이 외인성 화합물을 소개하기 위하여 이 방법을 이용할 수 있습니다. 특징적인 프로토콜은 살아있는 화상 진찰 실험을 위한 형광 단백질인 어떤 수용성 시약의 주입을 위한 절차를 설치하고 능력을 발휘하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 브로소필라 멜라노가스터 싱크티알 배아, J. Vis. Exp에서미토시스를 연구하기 위한 미세 주입기술인 브루스-마셔와 숄리에서 발췌한 것입니다. (2009).

조리법:

포도 주스 접시:

• 5.5g 바토 마가르

• 덱스트로스 또는 포도당 14.5g

• 7.15 g 자당

• 포도 주스 농축액 45ml(주스 100%)

• 204.5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

모든 재료를 섞고 전자레인지를 끓일 때까지 섞습니다.
2.8 ml 산 혼합 추가 (산 혼합: 20.9 ml 프로피오닉 산, 2.1 ml 인산, 27 ml H₂0)

35mm 페트리 요리에 섞어서 붓습니다. 실온에서 1~2일 동안 고형화하십시오. 플레이트가 곧 사용되지 않을 경우, 파라필름으로 밀봉하고 4 °C에서 유지 (사용하기 전에 RT에 평형 할 수 있도록).

효모 페이스트 :
효모 1 티스푼 (시그마 YSC2, 사카로미세스 cerevisiae 유형 II에서 효모)를 물에 녹여 두꺼운 페이스트를 형성합니다. 사용하기 직전에 각 포도 주스 접시에 소량을 놓습니다.

사출 버퍼:

• 150 mM K-아스파타테

• 10 mM K-인산염

• 20 mM 이미다졸, pH 7.2

헵탄 접착제:
이중 끈적끈적한 테이프를 풀고 100ml 병에 넣고 약 50ml 헵탄을 추가하고 병을 밀봉하고 며칠 동안 바위를 넣습니다. 사용 시 접착제가 너무 두껍으면 헵탄을 추가하십시오.

탈수 챔버:
100mm 페트리 접시를 가지고 35mm 접시의 한 부분을 내부에 넣고 "테이블"을 만들고 건조릿 (무수 칼슘 황산염)을 주변에 추가하여 건조기의 높이가 "테이블"과 커버보다 높지 않도록하십시오. 배아가 있는 커버슬립은 주사 전에 탈수에 대한 이 "테이블"에 놓일 것입니다. 그것은 적어도 일부 건조 기를 나타내는 사용 하 고 색상을 변경 하는 경우 그것을 변경 하는 것이 좋습니다.

프로토콜:
이 프로토콜은 Drosophila syncytial 태아로 거의 모든 가용성 시약을 주입하는 데 사용할 수 있습니다: 예를 들어, 관찰을 위한 형광 단백질 또는 표적 단백질 억제제 또는 둘 다.

1. 배아 수집

1. 평신도 케이지에 새로운 포도 주스 접시를 넣습니다.
2. 1 시간 후에이 접시를 제거하면 하루 중 첫 번째 컬렉션이며 종종 별로 좋지 않습니다. 폐기할 수 있습니다.
3. 매시간 접시를 변경하여 배아를 1시간 씩 계속 수집합니다.

2. 커버슬립 준비

1. 현미경 슬라이드의 한쪽에 50 x 22mm 커버슬립을 놓습니다. 네 모서리를 슬라이드에 테이프로 부착하여 이동하지 않습니다.
2. 면 팁 어플리케이터를 사용하여, 커버 슬립에 한 줄에 heptane 접착제의 한 층을 넣어 (접착제는 점성이 없어야하고 그렇지 않으면 더 많은 heptane을 추가).
3. 슬라이드에 이중 끈적 끈적한 테이프 조각을 커버슬립의 측면을 향합니다.

3. 배아 준비

참고: 배아는 수집 시작 후 약 2시간 후에 이미지화되어야 하므로 다음 단계를 시작하여 이 시간 내에 충분한 시간을 마칠 수 있습니다.

1. 촉촉한 브러쉬로 포도 주스 접시에서 배아를 조심스럽게 집어 들고 슬라이드에 이중 끈적 끈적한 테이프에 놓습니다.
2. 핀셋의 바깥 부분을 사용하여 초리온 (외부 멤브레인)이 열릴 때까지 배아를 이중 끈적 끈적한 테이프 위로 굴립니다.
3. 배아를 부드럽게 초리온 위로 굴려 서 트위저에 달라 붙어 커버슬립의 긴 면과 함께 커버슬립에 힙탄 접착제에 놓습니다. 10~20개의 배아를 한 줄로 설정합니다.
4. 커버슬립을 제거하고 탈수챔버에 3~8분 동안 배치합니다(이는 방의 습도와 주입되는 양에 따라 다름).
5. 진공 그리스가 있는 금속 챔버에 놓습니다.
6. 추가 탈수증을 피하기 위해 할로카본 오일 700으로 배아를 덮습니다. 배아는 이제 주사를 준비하고 있습니다.

4. 배아 주입

1. 16배 목표 하에서 배아를 찾으십시오.
2. 배아를 멀리 이동하고 초점 평면을 이동하지 않고 바늘을 찾습니다.
3. 바늘을 중앙에 대 고 x 또는 y 방향으로 이동 하지 않고 그것을 위로 이동.
4. 바늘이 열리지 않으면, 커버슬립의 가장자리를 시야에 두지만 바늘이 어디에 있는지는, 바늘을 같은 초점 평면으로 낮춥니다. 매우 신중하게 바늘에 닿을 때까지 커버 슬립을 이동하고 부드럽게 열어. 바늘이 열려 있으면 5 단계로 이동하십시오. (바늘은 충전하기 전에 수성불산으로 열 수 있습니다).
5. 태아를 보기에 놓습니다 (바늘이 있는 곳은 아님), 바늘을 오일로 낮추고 바늘에서 좋은 액체 방울을 얻을 수 있는지 확인하십시오.
6. 조심스럽게 하지만 꾸준히 바늘로 배아를 이동 하 고 배아에 드롭을 주입 하 고 멀리 배아를 이동. (또는 주사 장치의 지침을 따르십시오).
7. 모든 배아가 주입 된 후, 그들은 공초점 현미경에 관찰 할 준비가되어 있습니다.