Микроинъекция живых эмбрионов дрозофилы: Ранняя доставка реагентов в развивающийся эмбрион

Overview

Это видео описывает, как выполнять микроинъекции, которые доставляют реагенты в живые эмбрионы дрозофилы. Исследователи могут использовать этот метод для внедрения экзогенных соединений, таких как нуклеиновые кислоты и белки на ранних стадиях развития эмбриона. Рекомендуемый протокол демонстрирует, как настроить и выполнить процедуру для инъекции любого растворимого реагента-здесь, флуоресцентного белка для живых экспериментов изображений.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Brust-Mascher и Scholey, Microinjection Методы для изучения митоза в Drosophila меланогастер синцитиальный эмбрион, J. Vis. Exp. (2009).

Рецепты:

Виноградный сок тарелки:

• 5,5 г бакто-агара

• 14,5 г декстрозы или глюкозы

• 7,15 г сахарозы

• 45 мл концентрата виноградного сока (100% сок).

• 204,5 мл H₂0

• 625 х 10N НаОХ

Смешайте все ингредиенты и микроволновую печь до кипения.
Добавьте 2,8 мл кислой смеси (кислотная смесь: 20,9 мл пропионовой кислоты, 2,1 мл фосфорной кислоты, 27 мл H₂0)

Смешайте и вылейте на 35 мм чашки Петри. Пусть затвердеет при комнатной температуре в течение одного или двух дней. Если пластины не собираются использоваться в ближайшее время, печать с парафильмом и держать при 4 градусов по Цельсию (позволить equilibrate к RT перед использованием).

Дрожжевая паста:
Растворите около одной чайной ложки дрожжей (Sigma YSC2, дрожжи из Saccharomyces cerevisiae типа II) в воде, чтобы сформировать толстую пасту. Поместите небольшое количество этого на каждой тарелке виноградного сока непосредственно перед использованием.

Буфер инъекций:

• 150 мМ К-Аспартат

• 10 мМ К-фосфат

• 20 мМ имидазол, рН 7,2

Гептановый клей:
Разверните двойную липкую ленту и поместите в бутылку 100 мл, добавьте около 50 мл гептана, запечатайте бутылку и рок в течение нескольких дней. При использовании добавьте гептан, если клей слишком толстый.

Камера обезвоживания:
Возьмите 100 мм чашку Петри, положить одну часть 35 мм блюдо внутри, чтобы сделать "стол" и добавить Drierite (ангидроус сульфат кальция) вокруг него так, что высота Drierite не выше, чем "стол" и крышка. Обложка с эмбрионами будет помещена на этот "стол" для обезвоживания перед инъекцией. Это хорошая идея, чтобы использовать по крайней мере некоторые указания Drierite и изменить его, когда он изменил цвет.

протокол:
Этот протокол может быть использован для инъекции практически любого растворимого реагента в синцитиальный эмбрион Drosophila: Например, либо флуоресцентный белок для наблюдения или ингибитор целевого белка или оба.

1. Коллекция эмбрионов

1. Положите новую тарелку виноградного сока на клетку.
2. Снимите эту тарелку через час, это первая коллекция дня и часто не очень хорошо. Он может быть отброшен.
3. Изменение пластины каждый час, чтобы продолжать собирать эмбрионы в течение одного часа каждый.

2. Подготовка Coverslip

1. Положите 50 х 22 мм крышки на одной стороне слайда микроскопа. Лента четыре угла на слайд, чтобы он не двигается.
2. Используя хлопчатобумажный наконечником аппликатора, положите один слой гептаного клея в одну линию на крышку (клей не должен быть вязким и должен высохнуть в течение нескольких секунд, в противном случае добавить больше гептана).
3. Положите кусок двойной липкой лентой на слайде в сторону крышки.

3. Подготовка эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы должны быть изображены примерно через 2 часа после начала сбора, так что начните следующие шаги, позволяющие достаточно времени, чтобы закончить их в течение этого срока.

1. С увлажненной щеткой тщательно подберите эмбрионы из тарелки виноградного сока и поместите на двойную липкую ленту на слайде.
2. Используя внешнюю часть пинцета, переверните эмбрионы над двойной липкой лентой до тех пор, пока хорион (внешняя мембрана) не откроется.
3. Возьмите эмбрион, аккуратно перекатывая его над хорионом, чтобы он прилипает к пинцету и поместите его на гептановый клей на крышке с длинной стороной эмбриона параллельно длинной стороне крышки. Настройка от 10 до 20 эмбрионов в одном ряду.
4. Снимите крышку и поместите ее в камеру обезвоживания на 3-8 минут (это зависит от влажности помещения и количества вводимого).
5. Поместите на металлическую камеру с вакуумной смазкой.
6. Обложка эмбрионов с галоуглеродным маслом 700, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Эмбрионы готовы к инъекциям.

4. Инъекция эмбриона

1. Найти эмбрионы под 16x цели.
2. Перемещение эмбрионов прочь, и найти иглу, не перемещая фокусной плоскости.
3. Центр иглы и переместить его вверх, не перемещая его в х или у направлении.
4. Если игла не открыта, положите край крышки в поле зрения, но не там, где игла будет, и опустите иглу в ту же фокусную плоскость. Очень осторожно перемещать крышку, пока она не попадает в иглу и осторожно ломает его открытым. Если игла открыта, перейдите к шагу 5. (Иглы могут быть открыты с гидрофторной кислотой перед заполнением).
5. Положите эмбрионы в поле зрения (но не там, где игла будет), опустите иглу в масло и убедитесь, что вы получите хороший жидких капель из иглы.
6. Тщательно, но неуклонно двигайте эмбрион в иглу и впрысая каплю в эмбрион и двигайте эмбрион прочь. (Или следуйте инструкциям вашего инъекционного аппарата).
7. После того, как все эмбрионы были введены, они готовы к наблюдению на конфокальных микроскопов.