光点测定：一种调查 嗜血 性光电行为的方法

Overview

果蝇 幼虫对光敏感，对周围光线的变化有反应。此视频描述了测试其避免光线的能力的检测，称为光点检测。特色协议演示了如何用蓝光 LED 设置检测，并演示了如何记录动物的行为以响应光线相遇。

Protocol

此协议文本摘自 Sun等人，基于光点的分析德罗索菲拉·拉瓦尔光塔西斯，J. Vis. Exp. （2019）。

1. 成像系统的设置

1. 用铁夹夹紧一个高分辨率网络摄像机，在台式机的光点上方约10厘米处（图1）。
2. 将相机镜头的方向调整到桌面。通过 USB 接口将摄像机连接到计算机。
3. 在相机正下方的桌面上放置一个阿加板。
4. 打开带有 Windows 7 的计算机上的"Amcap9.22"软件，光点将自动显示在 AMcap 的窗口中。稍微向左或向右移动相机，以确保光线点靠近窗口中心。确保摄像机不会阻挡光路径。光点应该是完整和圆的。
   注： 该软件可以在 http://amcap.en.softonic.com/找到。
5. 在摄像机正下方 5-7 mm 处使用夹子修复 850 nm ± 3 nm 带通滤镜。
   注： 滤镜直径约2.5厘米，相机镜头直径小于1厘米，因此滤镜可以覆盖相机的视野。使用相机下方的滤镜，不应在 AMcap 的窗口中看到光点。
6. 将三个红外光生成 LED（中波长 = 850 nm）均匀地放置在 agar 板周围。每个 LED 应距离 agar 板的边缘约 5 厘米，LED 的镜头面应以 70° 向下角朝向阿加板。通过交流到直流转换器将 LED 连接到电源。
   注： 最好修复红外光 LED 的位置和角度，以确保该领域在各种实验试验中的亮度一致性，并方便以后的视频处理。
7. 在计算机和设备之间放置一块黑板。设置计算机屏幕的亮度，以防止计算机屏幕光线影响实验。
   注： 测量光的波长或强度时，保持环境黑暗。

2. 设置成像参数

1. 在 AMcap 软件的菜单上，选择 选项 | 视频设备 | 捕获格式，并将捕获视频的像素大小设置为 800 x 600，帧速率设置为 60 fps。
2. 从摄像机下方取出滤镜，在相机下方放置一把尺子，并调整相机对焦，使比例线清晰且与视场的宽度平行。
3. 单击 捕获 | 设置 | 视频捕获 以选择保存路径，单击 "开始录制"，记录对应于 600 像素的实际距离，并计算每个像素与实际距离的比例。

3. 光避免行为的视频记录

1. 通过所有实验保持 25.5 °C 的温度。如有需要，用空调控制室温。使用加湿器将湿度保持在 60%。
2. 拍摄名为"光区域1"的光点位置的简短视频。然后，将 850 nm ± 3 nm 滤镜移回以覆盖相机镜头。
   注： 在记录幼虫行为时，相机镜头由 850 nm ± 3 nm 滤光片覆盖，以便在视频中不显示光点。光点可以在视频中重建与幼虫以后与马特拉布。不要更改相机的位置，避免更改每个像素与步骤 2.3 中测量的实际距离的比例。
3. 打开远离实验装置的灯（即房间灯）。只要用眼睛清楚地看到幼虫，就尽量把光线调低。用勺子将幼虫从培养介质中取出，轻轻采摘三星幼虫，用蒸馏水清洗干净。小心一次洗一个幼虫，以避免饥饿的干扰。一个实验至少需要20个幼虫。
4. 在第 1.3 步期间将幼虫转移到放置在相机下方的 agar 板的中心。用刷子轻轻地从幼虫身上取出多余的水，或使用印迹纸去除幼虫中的水，以防止透镜下光线反射。关掉房间的灯，让幼虫在黑暗的环境中适应2分钟。
5. 打开LED灯产生红外光，轻轻将幼虫刷到板的中心。当幼虫开始直爬时，旋转板，使幼虫朝向光点。确保它从一开始就直接爬行，否则它可能无法访问光点。
6. 单击 捕获 | 设置 | 视频 捕获以选择保存路径，然后单击 "开始录制 "以录制。让幼虫爬向光点，进入光点，然后离开光点，直到它几乎脱离视野。点击 停止录制。如果幼虫在靠近前从光点转离，请直接单击 "停止记录"。
7. 将滤镜移离相机。拍摄名为"光区域2"的光点位置的简短视频，并将其与"光区域1"进行比较，以确保光点位置不变。如果观察到明显的位置变化，则丢弃数据。

Representative Results

图1：实验设置。 （A） 光点基幼虫快速光塔西测定设置的原理图表示。蓝线表示用作视觉刺激的可见光路径，红线表示红外光路径。箭头指示光的方向。850 nm 带通滤镜允许红外光通过，但它会阻挡可见光。（B） 光点测定设置的图像。应当指出，图像是在光线条件下拍摄的，以便更好地可视化。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%