Light Spot Assay: En metode til at undersøge Drosophila fototaktisk adfærd

Overview

Drosophila larver er lysfølsomme og reagerer på ændringer i det omgivende lys. Denne video beskriver en analyse, der tester deres evne til at undgå lys, kaldet lysplet assay. Den fremhævede protokol demonstrerer, hvordan man opsætter analysen med en blå lys LED og viser, hvordan man registrerer dyrets adfærd som reaktion på lysmødet.

Protocol

Denne protokoltekst er et uddrag fra Sun et al., Light Spot-Based Assay til analyse af Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Opsætning af billedbehandlingssystemet

1. Klem et webkamera med høj opløsning med et strygeclips, ca. 10 cm over lyspletten på skrivebordet (Figur 1).
2. Juster kameralinsens retning mod skrivebordet. kameraet til en computer via en USB-grænseflade.
3. Placer en agarplade på skrivebordet lige under kameraet.
4. Åbn "Amcap9.22"-softwaren på computeren med Windows 7, og lyspunktet vises automatisk i vinduet i AMcap. Flyt kameraet lidt til venstre eller højre for at sikre, at lyspunktet er nær midten af vinduet. Sørg for, at kameraet ikke blokerer lysstien. Lyspletten skal være komplet og rund.
   BEMÆRK: Softwaren kan findes på http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fastgør et 850 nm ± 3 nm båndpasfilter med et klip på 5-7 mm lige under kameraet.
   BEMÆRK: Filterets diameter er ca. 2,5 cm, og kameralinsen er mindre end 1 cm i diameter, så filteret kan dække kameraets synsfelt. Med filteret under kameraet skal lyspletten ikke ses i vinduet i AMcap.
6. Placer tre infrarøde lysgenererende lysdioder (central bølgelængde = 850 nm) jævnt omkring agarpladen. Hver LED skal være ca. 5 cm væk fra kanten af agarpladen, og LED'ens linseflade skal være i en 70° nedadgående vinkel mod agarpladen. Tilslut LED'erne til strømmen via VEK-til-DC-konverteren.
   BEMÆRK: Det er bedre at fastsætte positioner og vinkler af det infrarøde lys lysdioder for at sikre konsistens af lysstyrken af feltet i forskellige eksperimentelle forsøg og lette senere videobehandling.
7. Sæt et sort bræt mellem computeren og enheden. Angiv computerskærmens lysstyrke for at forhindre, at computerskærmlyset påvirker eksperimentet.
   BEMÆRK: Hold miljøet mørkt, når du måler bølgelængde eller intensitet af lyset.

2. Angivelse af parametre for billedbehandling

1. Vælg Indstillinger i menuen i AMcap-softwaren | | for videoenhed Hent format, og indstil pixelstørrelsen på den hentede video til 800 x 600 og billedhastigheden til 60 fps.
2. Fjern filteret under kameraet, sæt en lineal under kameraet, og juster kamerafokus for at gøre skalalinjen klar og parallel med bredden af videovisningsfeltet.
3. Klik på Hent | Opsætning af | Videooptagelse for at vælge lagringsstien, klik på Start optagelse, optag den faktiske afstand, der svarer til 600 pixel, og beregn forholdet mellem hver pixel og den faktiske afstand.

3. Videooptagelse af lys undgåelse adfærd

1. Der skal opretholdes en temperatur på 25,5 °C gennem alle forsøg. Kontroller rumtemperaturen med et klimaanlæg, hvis det er nødvendigt. Hold fugtigheden konstant på 60% med en luftfugter.
2. Tag en kort video af lyspunkt position med navnet "lightarea1". Flyt derefter 850 nm ± 3 nm filter tilbage for at dække kameralinsen.
   BEMÆRK: Ved optagelse af larveadfærd er kameralinsen dækket af filteret 850 nm ± 3 nm, så lyspletten ikke vises i videoen. Lyspletten kan rekonstrueres i videoer med larver senere med Matlab. Du må ikke ændre kameraets placering og undgå at ændre forholdet mellem hver pixel og den faktiske afstand målt i trin 2.3.
3. Tænd lyset (dvs. et rumlys) langt væk fra forsøgsenheden. Skru ned for lyset så lavt som muligt, så længe larverne tydeligt kan ses med øjnene. Tag larverne ud af kulturmediet med en ske, vælg forsigtigt en tredje instar larve, og vask den ren med destilleret vand. Vær omhyggelig med at vaske larve en ad gangen for at undgå interferens fra sult. Et enkelt eksperiment kræver mindst 20 larver.
4. Larven overføres til midten af agarpladen, der er placeret under kameraet under trin 1.3. Fjern forsigtigt overskydende vand fra larven med en børste, eller brug blottingpapir til at fjerne vand fra larven for at forhindre refleksion af lys under linsen. Sluk lyset i rummet og lad larven akklimatisere i 2 minutter i det mørke miljø.
5. Tænd LED-lyset for at generere infrarødt lys, og børst forsigtigt larven til midten af pladen. Når larven begynder at krybe lige, skal du dreje pladen for at få larven til at gå mod det lyse sted. Sørg for, at den gennemgår lige fra starten, ellers får den muligvis ikke adgang til lyspunktet.
6. Klik på Hent | Opsætning af | Videooptagelse for at vælge lagringsstien, og klik derefter på Start optagelse for at optage. Lad larven kravle mod lyspletten, gå ind i lyspletten, og lad derefter lyspletten stå, indtil den næsten er ude af synsfeltet. Klik på Stop optagelse. Hvis larven vender sig væk fra lyspletten, før du kommer tæt på, skal du direkte klikke på Stop optagelse.
7. Flyt filteret væk fra kameraet. Tag en kort video af placeringen af lyspletten med navnet "lightarea2" og sammenlign den med "lightarea1" for at sikre, at lyspletpositionen ikke ændres. Hvis der observeres en åbenlys positionsændring, skal du kassere dataene.

Representative Results

Figur 1: Eksperimentel opsætning. (A) Skematisk repræsentation af opsætningen for den lyse plet-baserede larve hurtig phototaxis assay. De blå linjer repræsenterer stierne for synligt lys, der bruges som visuel stimulering, og de røde linjer repræsenterer stierne for infrarødt lys. Pile angiver lysets retning. 850 nm båndpasfilteret gør det muligt for infrarødt lys at passere, men det blokerer synligt lys. (B) Et billede af set-up for lysplet assay. Det skal bemærkes, at billedet blev taget under lysforhold for bedre visualisering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%