Light Spot Assay: En metode for å undersøke drosophila fototaktisk oppførsel

Overview

Drosophila larver er lysfølsomme og reagerer på endringer i omkringliggende lys. Denne videoen beskriver en analyse som tester deres evne til å unngå lys, kalt lyspunktanalysen. Den omtalte protokollen demonstrerer hvordan du setter opp analysen med en blått lys LED og viser hvordan du registrerer dyrets oppførsel som svar på lysmøtet.

Protocol

Denne protokollteksten er et utdrag fra Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Oppsett av bildesystemet

1. Klem et høyoppløselig webkamera med en jernklips, ca. 10 cm over lyspunktet på skrivebordet (figur 1).
2. Juster retningen på kameralinsen mot skrivebordet. Koble kameraet til en datamaskin via et USB-grensesnitt.
3. Plasser en agarplate på skrivebordet rett under kameraet.
4. Åpne programvaren "Amcap9.22" på datamaskinen med Windows 7, og lyspunktet vises automatisk i vinduet til AMcap. Flytt kameraet litt til venstre eller høyre for å sikre at lyspunktet er nær midten av vinduet. Kontroller at kameraet ikke blokkerer lysbanen. Lyspunktet skal være komplett og rundt.
   MERK: Programvaren finner du på http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fest et 850 nm ± 3 nm båndpassfilter med en klips på 5-7 mm rett under kameraet.
   MERK: Diameteren på filteret er ca. 2,5 cm, og kameralinsen er mindre enn 1 cm i diameter, slik at filteret kan dekke kameraets visuelle felt. Med filteret under kameraet skal lyspunktet ikke ses i vinduet til AMcap.
6. Plasser tre infrarøde lysgenererende lysdioder (sentral bølgelengde = 850 nm) jevnt rundt agarplaten. Hver LED skal være ca 5 cm fra kanten av agarplaten, og linseflaten på LED-lampen skal være i en 70° nedovervinkel mot agarplaten. Koble lysdiodene til strømmen via AC-til-DC-omformeren.
   MERK: Det er bedre å fikse posisjonene og vinklene til de infrarøde lysdiodene for å sikre konsistens av lysstyrken på feltet i ulike eksperimentelle forsøk og lette senere videobehandling.
7. Sett et svart bord mellom datamaskinen og enheten. Angi lysstyrken på dataskjermen for å hindre at dataskjermlyset påvirker eksperimentet.
   MERK: Hold miljøet mørkt når du måler bølgelengde eller intensitet av lyset.

2. Stille inn parametere for avbildning

1. Velg Alternativer på menyen i AMcap-programvaren, | | videoenhet Opptaksformat, og sett pikselstørrelsen på den innspilte videoen til 800 x 600 og bildefrekvensen til 60 bps.
2. Fjern filteret fra under kameraet, plasser en linjal under kameraet og juster kamerafokuset for å gjøre skalalinjen klar og parallell med bredden på videovisningsfeltet.
3. Klikk Spill inn | Definere | Videoopptak for å velge lagringsbanen, klikk Start innspilling, registrer den faktiske avstanden som tilsvarer 600 piksler, og beregn forholdet mellom hvert bildepunkt og den faktiske avstanden.

3. Videoopptak av lysunngåelsesatferd

1. Opprettholde en temperatur på 25,5 °C gjennom alle eksperimenter. Kontroller romtemperaturen med et klimaanlegg om nødvendig. Hold fuktigheten konstant på 60% med en luftfukter.
2. Ta en kort video av lyspunktposisjonen som heter "lightarea1". Flytt deretter filteret på 850 nm ± 3 nm tilbake for å dekke kameralinsen.
   MERK: Når du tar opp larvadferd, er kameralinsen dekket av 850 nm ± 3 nm-filteret slik at lyspunktet ikke vises i videoen. Lyspunktet kan rekonstrueres i videoer med larver senere med Matlab. Ikke endre posisjonen til kameraet, og unngå å endre forholdet mellom hvert bildepunkt og den faktiske avstanden målt i trinn 2.3.
3. Slå på et lys (dvs. et romlys) langt borte fra den eksperimentelle enheten. Skru ned lyset så lavt som mulig, så lenge larvene tydelig kan ses med øynene. Ta larvene ut av kulturmediet med en skje, velg forsiktig en tredje-instar larve, og vask den ren med destillert vann. Vær forsiktig med å vaske larve en om gangen for å unngå forstyrrelser fra sult. Et enkelt eksperiment krever minst 20 larver.
4. Overfør larven til midten av agarplaten plassert under kameraet i trinn 1.3. Fjern forsiktig overflødig vann fra larven med en børste eller bruk blotting papir for å fjerne vann fra larven for å forhindre refleksjon av lys under linsen. Slå av romlyset og la larven akklimatisere seg i 2 min i det mørke miljøet.
5. Slå på LED-lyset for å generere infrarødt lys, og pensle forsiktig larven til midten av platen. Når larven begynner å krype rett, roterer du platen for å få larven til å gå mot lyspunktet. Pass på at den kryper rett fra starten, ellers kan det hende at den ikke får tilgang til lyspunktet.
6. Klikk Spill inn | Definere | Videoopptak for å velge lagringsbanen, og klikk deretter Start innspilling for å spille inn. La larven krype mot lyspunktet, gå inn i lyspunktet, og la deretter lyspunktet være til det er nesten ute av synsfeltet. Klikk Stopp innspilling. Hvis larven vender seg bort fra lyspunktet før den nærmer seg, klikker du Stopp registreringdirekte .
7. Flytt filteret bort fra kameraet. Ta en kort video av posisjonen til lyspunktet som heter "lightarea2" og sammenlign det med "lightarea1" for å sikre at lyspunktposisjonen ikke endres. Hvis det observeres en åpenbar posisjonsendring, forkaster du dataene.

Representative Results

Figur 1: Eksperimentelt oppsett. (A) Skjematisk representasjon av oppsettet for den lette spotbaserte larval raske fototaxis-analysen. De blå linjene representerer banene til synlig lys som brukes som visuell stimulering, og de røde linjene representerer banene til infrarødt lys. Pilene angir retningen på lyset. 850 nm båndpassfilteret gjør at infrarødt lys kan passere, men det blokkerer synlig lys. (B) Et bilde av oppsettet for lyspunktanalysen. Det skal bemerkes at bildet ble tatt under lysforhold for bedre visualisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%