Ensayo de punto de luz: un método para investigar el comportamiento fototáctico de Drosophila

Overview

Las larvas de Drosophila son sensibles a la luz y responden a los cambios en la luz circundante. Este video describe un ensayo que prueba su capacidad para evitar la luz, llamado ensayo de punto de luz. El protocolo destacado muestra cómo configurar el ensayo con un LED de luz azul y muestra cómo registrar el comportamiento del animal en respuesta al encuentro de luz.

Protocol

Este texto de protocolo es un extracto de Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Configuración del sistema de imágenes

1. Sujete una cámara web de alta resolución con un clip de hierro, a unos 10 cm por encima del punto de luz del escritorio (Figura 1).
2. Ajuste la orientación de la lente de la cámara hacia el escritorio. Conecte la cámara a un ordenador a través de una interfaz USB.
3. Coloque una placa de agar en el escritorio justo debajo de la cámara.
4. Abra el software "Amcap9.22" en el ordenador con Windows 7, y el punto de luz se mostrará automáticamente en la ventana de AMcap. Mueva la cámara ligeramente a la izquierda o a la derecha para asegurarse de que el punto de luz está cerca del centro de la ventana. Asegúrese de que la cámara no bloquee la ruta de luz. El punto de luz debe ser completo y redondo.
   NOTA: El software se puede encontrar en http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fije un filtro de paso de banda de 850 nm ± de 3 nm con un clip de 5-7 mm justo debajo de la cámara.
   NOTA: El diámetro del filtro es de aproximadamente 2,5 cm, y la lente de la cámara tiene menos de 1 cm de diámetro, por lo que el filtro puede cubrir el campo visual de la cámara. Con el filtro debajo de la cámara, el punto de luz no debe verse en la ventana de AMcap.
6. Coloque tres LED generadores de luz infrarroja (longitud de onda central = 850 nm) uniformemente alrededor de la placa de agar. Cada LED debe estar a unos 5 cm del borde de la placa de agar, y la cara de la lente del LED debe estar en un ángulo descendente de 70° hacia la placa de agar. Conecte los LED a la alimentación a través del convertidor de CA a CC.
   NOTA: Es mejor fijar las posiciones y ángulos de los LED de luz infrarroja para garantizar la consistencia del brillo del campo en varios ensayos experimentales y facilitar el procesamiento posterior de vídeo.
7. Coloque una placa negra entre el ordenador y el dispositivo. Establezca el brillo de la pantalla del ordenador para evitar que la luz de la pantalla del ordenador afecte al experimento.
   NOTA: Mantenga el ambiente oscuro al medir longitud de onda o intensidad de la luz.

2. Ajuste de parámetros de imágenes

1. En el menú del software AMcap, elija Options | Dispositivo de vídeo | Capture el formatoy establezca el tamaño de píxel del vídeo capturado en 800 x 600 y la velocidad de fotogramas en 60 fps.
2. Retire el filtro de debajo de la cámara, coloque una regla debajo de la cámara y ajuste el enfoque de la cámara para que la línea de escala sea clara y paralela al ancho del campo de visión del vídeo.
3. Haga clic en Capturar | Configurar | Captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado, haga clic en Iniciar grabación,grabe la distancia real correspondiente a 600 píxeles y calcule la relación de cada píxel con la distancia real.

3. Grabación de vídeo del comportamiento de evitación de la luz

1. Mantenga una temperatura de 25.5 ° C a través de todos los experimentos. Controle la temperatura ambiente con un aire acondicionado si es necesario. Mantenga la humedad constantemente al 60% con un humidificador.
2. Tome un breve video de la posición del punto de luz llamado "lightarea1". A continuación, mueva el filtro de 850 nm ± de 3 nm hacia atrás para cubrir la lente de la cámara.
   NOTA: Al registrar el comportamiento larvario, la lente de la cámara está cubierta por el filtro de 850 nm ± 3 nm para que el punto de luz no se muestre en el video. El punto de luz se puede reconstruir en videos con larvas más tarde con Matlab. No cambie la posición de la cámara y evite cambiar la relación de cada píxel a la distancia real medida en el paso 2.3.
3. Encienda una luz (es decir, una luz de habitación) lejos del dispositivo experimental. Baje la luz lo más bajo posible, siempre y cuando las larvas se puedan ver claramente con los ojos. Saca las larvas del medio de cultivo con una cuchara, recoge suavemente una larva de tercera instar y lávala limpia con agua destilada. Tenga cuidado de lavar las larvas de uno en uno para evitar interferencias por el hambre. Un solo experimento requiere al menos 20 larvas.
4. Transfiera la larva al centro de la placa de agar colocada debajo de la cámara durante el paso 1.3. Retire suavemente el exceso de agua de la larva con un cepillo o use papel humectante para eliminar el agua de la larva para evitar el reflejo de la luz debajo de la lente. Apague la luz de la habitación y deje que la larva se aclimate durante 2 minutos en el ambiente oscuro.
5. Encienda la luz LED para generar luz infrarroja y cepille suavemente la larva en el centro de la placa. Cuando la larva comience a arrastrarse recta, gire la placa para hacer que la larva se dirija hacia el punto de luz. Asegúrese de que se arrastra directamente desde el principio, o de lo contrario puede que no obtenga acceso al punto de luz.
6. Haga clic en Capturar | Configurar | Capture de vídeo para seleccionar la ruta de guardado y, a continuación, haga clic en Iniciar grabación para grabar. Permita que la larva se arrastre hacia el punto de luz, entre en el punto de luz y, a continuación, deje el punto de luz hasta que esté casi fuera del campo de visión. Haga clic en Detener grabación. Si la larva se aleja del punto de luz antes de acercarse, haga clic directamente en Detener grabación.
7. Aleje el filtro de la cámara. Tome un breve video de la posición del punto de luz llamado "lightarea2" y compárela con "lightarea1" para asegurarse de que la posición del punto de luz no se cambia. Si se observa un cambio de posición obvio, deseche los datos.

Representative Results

Figura 1: Configuración experimental. (A) Representación esquemática de la configuración para el ensayo de fototaxis rápido larvario basado en manchas ligeras. Las líneas azules representan los trazados de luz visible utilizados como estimulación visual, y las líneas rojas representan los trazados de la luz infrarroja. Las flechas indican la dirección de la luz. El filtro de paso de banda de 850 nm permite pasar la luz infrarroja, pero bloquea la luz visible. (B) Una imagen de la configuración para el ensayo de punto de luz. Cabe señalar que la imagen fue tomada en condiciones de luz para una mejor visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%