Light Spot Assay: En metod för att undersöka Drosophila fototaktiskt beteende

Overview

Drosophila larver är ljuskänsliga och svarar på förändringar i omgivande ljus. Den här videon beskriver en analys som testar deras förmåga att undvika ljus, så kallad light spot-analys. Det presenterade protokollet visar hur man ställer in analysen med en blåljuslampa och visar hur man registrerar djurets beteende som svar på ljusmötet.

Protocol

Denna protokolltext är ett utdrag från Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Inrättande av bildsystemet

1. Kläm fast en högupplöst webbkamera med ett järnklämma, ca 10 cm ovanför ljuspunkten på skrivbordet (Bild 1).
2. Justera kameralinsens orientering mot skrivbordet. Anslut kameran till en dator via ett USB-gränssnitt.
3. Placera en agarplatta på skrivbordet precis under kameran.
4. Öppna programvaran "Amcap9.22" på datorn med Windows 7, så visas ljuspunkten automatiskt i fönstret på AMcap. Flytta kameran något åt vänster eller höger för att säkerställa att ljuspunkten är nära mitten av fönstret. Se till att kameran inte blockerar ljusvägen. Ljuspunkten ska vara komplett och rund.
   OBS: Programvaran finns på http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixera ett 850 nm ± 3 nm bandpassfilter med ett klipp på 5-7 mm precis under kameran.
   OBS: Filtrets diameter är ca 2,5 cm och kameralinsen är mindre än 1 cm i diameter, så filtret kan täcka kamerans synfält. Med filtret under kameran ska ljuspunkten inte ses i AMcaps fönster.
6. Placera tre infraröd-ljusgenererande lysdioder (central våglängd = 850 nm) jämnt runt agarplattan. Varje lysdiod ska vara ca 5 cm från kanten av agarplattan, och lysdiodens linssida ska vara i 70° nedåtriktad vinkel mot agarplattan. Anslut lysdioderna till strömmen via ac-till-dc-omvandlaren.
   OBS: Det är bättre att fixa positionerna och vinklarna på de infraröda ljusdioderna för att säkerställa konsekvens i fältets ljusstyrka i olika experimentella försök och underlätta senare videobehandling.
7. Sätt ett svart tavla mellan datorn och enheten. Ange datorskärmens ljusstyrka så att datorskärmslampan inte påverkar experimentet.
   OBS: Håll miljön mörk när du mäter ljusets våglängd eller intensitet.

2. Ställa in parametrar för avbildning

1. På menyn i AMcap-programvaran väljer du Alternativ | Videoenhet | Ta formatoch ställ in pixelstorleken på den fångade videon till 800 x 600 och bildhastigheten till 60 fps.
2. Ta bort filtret under kameran, placera en linjal under kameran och justera kamerans fokus för att göra skallinjen tydlig och parallell med videofältets bredd.
3. Klicka på | Ställ in | Videoinspelning för att välja sparbanan, klicka på Starta inspelning, spela in det faktiska avståndet motsvarande 600 pixlar och beräkna förhållandet mellan varje pixel och det faktiska avståndet.

3. Videoinspelning av lätt undvikande beteende

1. Håll en temperatur på 25,5 °C genom alla experiment. Kontrollera rumstemperaturen med luftkonditionering vid behov. Håll luftfuktigheten konstant på 60% med en luftfuktare.
2. Ta en kort video av ljuspunktspositionen som heter "lightarea1". Flytta sedan tillbaka 850 nm ± 3 nm-filtret för att täcka kameralinsen.
   OBS: Vid inspelning av larvbeteende täcks kameralinsen av filtret 850 nm ± 3 nm så att ljuspunkten inte visas i videon. Ljuspunkten kan rekonstrueras i videor med larver senare med Matlab. Ändra inte kamerans position och undvik att ändra förhållandet mellan varje pixel och det faktiska avståndet mätt i steg 2.3.
3. Tänd en lampa (dvs. ett rumsljus) långt borta från den experimentella enheten. Vrid ner ljuset så lågt som möjligt, så länge larverna tydligt kan ses med ögonen. Ta larverna ur odlingsmediet med en sked, välj försiktigt en tredje-instar larva och tvätta den ren med destillerat vatten. Var noga med att tvätta larven en i taget för att undvika störningar från hunger. Ett enda experiment kräver minst 20 larver.
4. Överför larven till mitten av agarplattan som placeras under kameran under steg 1.3. Ta försiktigt bort överflödigt vatten från larven med en borste eller använd blottingpapper för att avlägsna vatten från larven för att förhindra reflektion av ljus under linsen. Stäng av rumslampan och låt larven acklimatisera sig i 2 minuter i den mörka miljön.
5. Tänd LED-lampan för att generera infrarött ljus och borsta försiktigt larven till mitten av plattan. När larven börjar krypa rakt, rotera plattan för att göra larvhuvudet mot ljuspunkten. Se till att den kryper direkt från början, annars kanske den inte får tillgång till ljuspunkten.
6. Klicka på | Ställ in | Videoinspelning för att välja spara sökväg och klicka sedan på Starta inspelning för att spela in. Låt larven krypa mot ljuspunkten, gå in i ljuspunkten och lämna sedan ljuspunkten tills den nästan är utanför synfältet. Klicka på Stoppa inspelning. Om larven vänder sig bort från ljuspunkten innan du kommer nära klickar du direkt på Stoppa inspelning.
7. Flytta filtret bort från kameran. Ta en kort video av ljuspunktens position med namnet "lightarea2" och jämför den med "lightarea1" för att säkerställa att ljuspunktspositionen inte ändras. Om en uppenbar positionsändring observeras, kassera data.

Representative Results

Figur 1: Experimentellt uppförande. A)Schematisk återgivning av uppsättningen för den ljuspunktsbaserade larvbaserade snabbfototaxisanalysen. De blå linjerna representerar banor av synligt ljus som används som visuell stimulering, och de röda linjerna representerar banor för infrarött ljus. Pilarna anger ljusets riktning. 850 nm bandpassfiltret tillåter infrarött ljus att passera, men det blockerar synligt ljus. B)En bild av placeringen av ljuspunktsanalysen. Det bör noteras att bilden togs under ljusförhållanden för bättre visualisering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%